[发明专利]一种广谱性质粒稳定因子PSF－Cxc及其分离方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程；具体地说，涉及质粒的稳定技术。

背景技术

无论在基因工程的研究领域还是在工业和农业应用领域，质粒的稳定性都是非常重要的关键技术。通过大量深入的研究，人们目前对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)的质粒稳定因子及其广泛应用有了全面的认识。但是，人们对革兰氏阳性菌的质粒及其稳定因子却知之甚少。因为作为基因工程载体的E.coli质粒不能有效地在革兰氏阳性菌里繁殖，因此限制了有关革兰氏阳性菌的基础研究和应用研究。Clavibacter Xyli subsp.cynodontis(Cxc)是一种革兰氏阳性菌，能广泛寄生于植物而不引起明显的植物病症。部分Cxc菌株含有天然质粒(pCXC100)，我们发现在没有任何选择的条件下pCXC100能稳定地在Cxc菌中遗传。我们从pCXC100中分离出了一段长约0.8Kb的广谱性质粒稳定因子(Plasmid Stabilization Function from Cxc，简称PSF-Cxc)，并对此稳定因子在其它质粒中的稳定效果进行了测试。我们发现PSF-Cxc能稳定不同来源的质粒，而且在Cxc和E.coli中有相同稳定效果。PSF-Cxc可以在Cxc和E.coli中稳定多种质粒，有广阔的应用前景。到目前为止，我们未发现有任何类似的文献报道或专利报道，也未在基因数据库(GenBank)中发现任何与它同源的序列。

发明内容

本发明的目的是：提供一种广谱性质粒稳定因子(PSF-Cxc)；提供一种分离PSF-Cxc的方法；提供一种将PSF-Cxc应用于科研、工农业生产方面的方法。

本发明的技术方案是：

1、分离PSF-Cxc的方法：

通过适当限制性内切酶把pCXC100切成不同长度能覆盖整个pCXC100全长的DNA片段(10-24.5Kb长)，把这些片段克隆到E.coli质粒pBR325上的合适酶切位点得到质粒pCXC101，pCXC102，pCXC103，pCXC104和pCXC105。通过稳定性检测，发现只有pCXC101和pCXC105能100％稳定地在Cxc和E.coli里传代。所以确定PSF-Cxc存在于pCXC101和pCXC105所包含的pCXC100的DNA片段里。(图1A)

把pCXC101所含的DNA插入片段用合适的限制性内切酶进行酶切，并把所得到的DNA片段重新克隆到pBR325的相应酶切位点，得到质粒pCXC106，pCXC107，pCXC108，pCXC109和pCXC110。稳定性检测发现只有pCXC106和pCXC108能稳定在Cxc和E.coli里传代，表明PSF-Cxc存在于pCXC106和pCXC108所共有的约5.5Kb长的NcoI-SmaI DNA片段内。(图1A)

用NcoI酶切质粒pCXC106，然后用DNase I在锰离子存在的情况下消解此线形质粒的两端，通过控制消解时间得到不同的DNA片段。消解过的DNA进行BglII酶切，分离出的不同长度的酶切片段，将其克隆入E.coli质粒pBCSK(+)的EcoRV和BamHI酶切位点，得到克隆pCXC111，pCXC112，pCXC113和pCXC114。因为消解后的DNA片段不含有完整的Cxc复制子，因而以上克隆不能在Cxc中复制，只能转化入E.coli细胞内进行稳定性检测。检测表明pCXC113含有PSF-Cxc的必需的DNA片段。(图1B)

用HindIII和KpnI酶切pCXC113，然后用Exonuclease III和S1 nuclease组合的消解试剂盒处理。通过控制消解时间得到丢失了不同长度DNA片段的pCXC113，自连后得到一系列新质粒，pCXC116和pCXC117是其中的两个。稳定性检测表明这两种质粒均不含有功能的PSF-Cxc。(图1B)

用XbaI酶切pCXC113，用Klenow酶填平粘末端以防止Exonuclease III从Hind III一端消解质粒。再用EcoRI酶切此线化的质粒，用Exonuclease III和S1 nuclease组合的消解试剂盒处理。通过控制消解时间得到丢失了不同长度DNA片段的pCXC113，自连后得到一系列新质粒，pCXC119和pCXC120是其中的两个。稳定性检测表明pCXC119能100％稳定在E.coli细胞内传代，而pCXC120不能。所以pCXC119含有功能的PSF-Cxc。(图1B)