[发明专利]使用密码子扫描规则的DNA芯片

说明书

发明领域

本发明涉及DNA芯片，更具体而言，涉及被设计用于检测在整个由本发明的密码子扫描规则确定的待调查密码子区域中发生的突变的寡核苷酸探针的制备方法、使用由所述方法制备的探针制备DNA芯片的方法、由所述方法制备的DNA芯片和使用所述DNA芯片检测遗传突变的方法。

发明背景

由于人类基因组计划正接近完成，生命现象的基础——基因，正越来越受到关注。在所估计的约100,000个人类基因中，约10,000个基因已被识别，其中大多数与遗传疾病直接相关。因此，对于由突变的疾病相关基因所表达的蛋白的功能失调所引起的遗传疾病的研究和所述疾病的诊断方法，受到越来越多的关注。如果现在可及早识别出遗传疾病，则能够避免其发病，但是，由于缺乏诊断工具和有关疾病的信息而限制了对该疾病的早期诊断。鉴于以上情况，有必要开发出解决所述问题的技术，最近出现的DNA芯片技术正是对上述问题的解决方法之一。

例如，其中将大量DNA探针固定在固相载体如玻璃的表面上的DNA芯片技术，由于其在多种条件下具有常规技术所不具有的满足快速和大量分析的要求的优点，而正在成为关注的焦点(参见：Shena，M.等，Science，270：467-470，1995)。DNA芯片的应用范围分成两个主要的领域，即对基因表达的分析和对突变例如SNP(单核苷酸多态现象)的分析(参见：Halushka，M.等，Nature Genetics，22：239-247，1999)。当前，最普遍用于分析SNP或突变的DNA芯片是称为GeneChip^TM的芯片，其由美国加州的Affymetrix制造(参见：www.affymetrix.com)。GeneChip^TM是利用用于生产半导体的照相平版印刷法和用于在固相载体上原位合成DNA的固相合成技术制造的，这些用于制造携带超过100,000个DNA探针的DNA芯片的技术具有以下优点，它能以同步方式制备统一量的多种DNA片段。但是，这些照相平版印刷技术需要使用光掩膜，而这会需要更多的劳动并给制造商带来高成本。此外，该技术具有以下缺点：在整个制造DNA芯片的过程中需要大量的设备，使得DNA芯片的制造成本很高；不可能只制备各种所需的探针；和不能将其他探针补充到已制得的芯片中。基于这些原因，照相平版印刷术并不适合被选为制造用于选择性地筛选目的突变的DNA芯片的技术。

另一方面，用于将预先合成的感兴趣的探针固定在固相载体上的定位技术，已用于制造DNA芯片。在定位技术中，固定探针的方法根据所使用的探针的类型而改变：对于利用PCR(聚合酶链反应)产物作为探针的cDNA芯片，可用化学反应将探针固定在载体上，所述化学反应在PCR产物的胸腺嘧啶基团和固相表面上的聚赖氨酸的氨基基团之间进行(参见：Southern E.等，Nature Genetics，21：5-9，1999)，但是，对于利用DNA片段为探针的DNA芯片，上述化学反应不能用于固定探针，因为DNA片段的长度短(约20nt)。由于存在上述问题，目前只有由照相平版印刷术制造的、其中探针在固相载体上原位合成的DNA芯片得以商品化，而通过将DNA片段定位到尼龙膜或包被有聚合物凝胶的玻璃上而制得的DNA芯片未得以商品化。因此，在本领域中急切需要的是开发出在不使用昂贵的照相平版印刷技术来固定DNA探针的情况下能用于诊断突变的DNA芯片。

迄今为止，已报道了两种针对检测突变所需的DNA探针的设计的方法(参见：Hacia，J.D.等，Nature Genetics，21：42-47，1999)，一个是信号规则的获得，其中对所有可能的突变制备了互补探针，另一个是信号规则的丢失，其中通过靶DNA节段的扫描检测一个核苷酸在某时与某一长度的寡核苷酸探针的互补结合。这些规则不用于检测所选突变，而用于通过利用大量的由照相平版印刷术制造的探针分析整个核苷酸序列来筛选突变。

信号规则的获得即为，被发现的是只针对与被调查区域的序列完美匹配的探针的信号，且针对每一突变位置制备了插入有所有可能的核苷酸(A、G、T和C)的DNA探针。因此，可制备所有可能数目的与靶DNA节段互补且在特定位置上存在替换、插入和缺失的序列变化的寡核苷酸探针。目前，尽管使用此方法所设计的探针进行的核苷酸序列分析显示出高于90％的准确度，但存在以下问题，即很难排除在插入突变情况下的碱基对错配，以及因在杂交反应中不可避免地发生错配而实际上不可能在不对杂交和洗涤条件进行优化的情况下检测和分析突变。