[发明专利]铁皮石斛芽簇及其制备工艺和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种铁皮石斛及其制备工艺和用途。

背景技术

石斛是常用名贵中药，具有养阴清热、生津止渴、明目强身等多种功效，应用历史非常悠久。作为一种名贵中药，石斛除配伍入药外，近年来国内外对石斛进行了大量深层次的开发，对石斛的需求量也越来越大。

但由于石斛属植物自然繁殖率很低，加上人们长期无节制的采挖，造成野生资源严重贫乏。因此，石斛的栽培对缓解资源紧张局面、保护生物的多样性、满足人民医疗保健需要及出口创汇等起着责无旁贷的作用。

目前，对于石斛人工培育技术的研究主要集中在利用野生石斛种子苗的不同部位组织进行愈伤组织诱导和原球茎的诱导，然后从愈伤组织、原球茎直接分化培养，获取再生苗。但是，这些技术还存在许多不足之处：

1)培育时间较长，获取能符合移栽要求的种子苗或组织培养苗分别需10个月至12个月左右的时间；

2)移栽苗的成活率较低，一般为50％左右；

3)生长周期较长，人工栽培的植株需生长3-4年左右，才能采集作为药材；

4)愈伤组织的活性成分及有效含量低。野生石斛均用植株作为药材来源，其植株属于分化型产物，愈伤组织则属于未分化型培养物，而对很多药用植物的成分测定均证明末分化型愈伤组织的活性成分及有效含量低。

所以，如何开发一种既能缩短石斛的生长周期，又能保持活性成分相对稳定的培养技术，一直是研究人员所努力的方向。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种铁皮石斛芽簇，它生长速度快，其有效成分的含量与野生型石斛相似，而且能够保持有效成分含量相对稳定。

本发明的另一个目的，在于提供一种生长快速的铁皮石斛芽簇的制备工艺，主要是利用细胞水平诱变和细胞全能性的原理，动摇和改变其生长缓慢的特性。

本发明的另一个目的，在于提供一种铁皮石斛芽簇用于制造食用无菌干粉的用途。

本发明提供的制备铁皮石斛牙簇的方法，是根据细胞全能性的原理，植株的每一个离体细胞可以在适宜的培养条件下生长发育成与母体完全一样的植株：以及细胞变异原理，即细胞愈伤组织在离体培养过程中会发生无性系变异，对离体培养的细胞或愈伤组织给予诱变处理，可以增加变异范围和提高变异频率。因此，我们首先对石斛细胞或愈伤组织进行诱变以及引发无性系变异。

取野生铁皮石斛或种子苗，用其茎尖，芽尖，根尖作为外植体(这些组织内细胞的全能性强)，经表面灭菌(70-80％乙醇或灭菌灵)15-20分钟，切成薄片，置于无菌诱导培养基内(2/3 MS、500mg/L CH、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、2-4％蔗糖、0.6％琼脂)，经50天左右的培养，获得大量愈伤组织。愈伤组织置入液体培养基(2/3 N₆、500mg/MlCH、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、NAA、3-5％山梨糖)。在摇床上培养30-40天(120转/分)，形成悬浮细胞或细胞团。培养温度22-25℃。在无菌条件下将经灭菌的80mg/L平阳霉素(一种安全低毒诱变剂)与愈伤组织或细胞团共培养12-24小时左右。

用悬浮细胞或愈伤组织进行2-3次继代培养，继代培养基为2/3 N₆、500mg/L的CH、2，4-D、NAA、KT、3-4％蔗糖、0.6％琼脂。每代培养35-45天，培养温度22-25℃。

将经过继代培养的细胞团或愈伤组织和修复培养基(2/3 MS、15％椰汁、3-5％山梨糖)中浅层培养10天左右的经诱变处理的细胞团或愈伤组织先置于分化培养基(2/3 MS、NAA、KT、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、2-3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养，40天后从各种再生物中选择芽簇型再生物。芽簇置于增殖培养基(2/3 MS或N₆、500mg/L的CH、KT、6-BA、NAA、2-3％蔗糖)上形成芽簇群。通过上述技术培养可以使变异细胞分化形成再生物(包括芽簇)，这类再生物中含有生长速率快且有效成分及含量与野生铁皮石斛相近的变异型芽簇。