[发明专利]用于转基因及定向诱变筛选的系统、方法和装置

说明书

相关申请的交叉参考

根据U.S.C.§119(e)，本申请要求2000年9月6日申请的美国临时申请60/230,371的优先权。该申请全文引入本文作参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及用于转基因及定向诱变筛选的系统。另外，本发明涉及检测和筛选来自组织样品的指定遗传序列或其部分的各种方法。更具体地，本发明涉及用于转基因及定向诱变筛选的高容积装置。

相关现有技术的描述

得自生物体DNA的突变的基因组修饰可被转移至子代，如果这类突变存在于该生物体的配子中，这称为种系突变。这些突变可使用重组DNA技术得自基因的遗传操作，或者可通过用化学或物理手段攻击DNA而引入。通过重组DNA技术引入的DNA可衍生自许多来源，包括但不限于来自病毒、支原体、细菌、真菌、酵母和脊索动物门包括哺乳动物如人。重组DNA技术使得可以导入、删除或置换生物体的DNA。将DNA随机导入细胞可通过诸如转染(包括电穿孔、脂转染)、注射(原核注射、核移植)或转导(病毒感染)等技术实现。随机突变(点突变、缺失、扩增)可通过用化学诱变原处理细胞或将细胞进行物理处理如X-辐射或线性能量转移辐射(LET)而产生。在生物体内定向添加、缺失或置换DNA(诱导的或非诱导的)可通过同源重组实现。诱导系统采用序列特异性重组酶如Cre-LoxP(美国专利号5,654,182和5,677,177)和FLP/FRT酶如Cre-LoxP(美国专利号5,654,1 82和5,677,177)和FLP/FRT(美国专利号5,527,695)(引入本文作参考)。

转基因生物体是携带衍生自另一物种的稳定整合入它们的基因组的DNA序列(基因或基因片段)的生物体。转基因哺乳动物一般通过将DNA微注射进受精卵的原核而产生，这项技术中DNA的拷贝数及DNA整合入宿主基因组的位点是不可控的。转基因品系是指将外来DNA序列传递至其子代的生物体。

定向突变、定位诱变或基因定向所描述的是这样的方法，其采用DNA的同源重组改变宿主基因组内的特异DNA序列。这可导致一基因的失活(剔除突变)，或该基因的遗传改变(敲入(knock-in)突变)。在哺乳动物中这可通过将一克隆的突变基因片段(定向构建体)转染进胚胎干细胞(ES细胞)，之后经同源重组置换ES细胞中的内源基因片段而实现。衍生自这些ES细胞的动物将在其基因组中携带所述的定向突变。这一技术的进一步的改进包括诱导型基因改变，其中一含有位点特异性重组酶(Cre，FLP)的识别序列(LoxP或FRT序列)的DNA片段定向到该内源基因。重组酶在该定向的ES细胞或ES细胞衍生的动物中的表达将导致以该识别位点为侧翼的DNA片段的缺失。根据定向构建体的构造，可导致定向基因的失活、活化或改变。动物中的诱导型系统的优点是根据特异激活重组酶的活性，基因改变可在任何时间点或任何组织中导入。这可通过将重组酶置于诱导型启动子(化学或激素诱导型启动子)的控制下而实现。

转基因及定向诱变筛选用于确定一基因组是否具有内源存在的或已被修饰、突变或基因工程化的特异基因序列。筛选基因组DNA是否具有这些修饰或突变。基因组DNA由于其大小足以固定在基质上。基因组DNA包括编码和非编码区，因此，基因组DNA含有外显子和内含子、启动子和基因调控区、端粒、复制源点和非功能性基因间DNA。基因组DNA是甲基化双链分子。固定化cDNA与基因间DNA。基因组DNA是甲基化双链分子。固定化cDNA与PCR扩增子的不同在于分子小得多。另外，生物化学修饰事件如甲基化在小分子中不发生。Shena，M.(2000)DNA微阵列：一种实用途径，牛津大学出版社，纽约(引入本文作参考)。

转基因筛选目前是手工操作。目前的手工系统耗时，且由于实验室甚至实验室人员的技术不同而可能产生不同的结果。目前，使用southern印迹技术的研究人员需要超过一周的时间筛选组织样品中的转基因或定向突变。在一替代技术中，可在一Eppendorfmicrotube_(Brinkmann Instruments，Westbery，NY)中进行多达30个PCR(聚合酶链反应)，并在一凝胶上分离。这一方法在大多数实验室中需要3-7天。产业上需要提供用于更精确、更快和高容积转基因及定向诱变筛选的系统和方法。

发明简述

本发明提供了对上述问题的独特的解决方案，即提供了用于自动化转基因及定向诱变测试的方法和系统。