[发明专利]检测病原微生物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及检测病原微生物的方法，所述方法包括区分不同种的微生物。该方法特别适用于检测和诊断由病原微生物导致的感染，这种感染用传统方法进行检测和诊断非常困难和/或费时费力。该方法有赖于对被称之为P3和/或P19区的RNase P RNA基因特异性可变区的分析。

发明背景

RNase P是存在于所有活性细胞中的酶。它催化tRNA前体分子中5’前导序列的切除。在细菌中，RNase P包括长度大约为400nt的RNA分子(11，28)和一个小蛋白(大约120aa)(33)。在区分细菌时，业已显示，RNA等分在体外可以作为有效催化剂发挥功能(12)；因此至少在这些细菌中，RNase P是一种核酶(催化化学反应的RNA分子)。细菌的RNase P RNAs在结构上主要分为两类。A型是最常见的结构分类，而B型仅存在于低G+C的革兰阳性细菌中(50)。很多细菌系的RNase P RNA的二级结构特征业已明了，在螺旋上存在的差异提供了非常有用的动植物系统发育信息(51)。

RNase P RNA基因序列在细菌菌群间并非非常保守(5)，但在一个属中，基因通常非常近似。在RNase P RNA数据库中有数百种RNaseP RNA序列存在(http：//jwbrown.mbio.ncsu.edu/RNaseP/home.html)。

衣原体目是一组专性细胞内细菌，具有独特的发育周期和致病性。它们寄生于人类和多种动物。衣原体科最近又分为两个属，衣原体和Chlamydophila，包括9个种(43)。此外，有些新科也属于衣原体目，它们包括副衣原体科和simkaniaceae(43)。副衣原体科的典型种类是parachlamydia acanthamoebae，它是阿米巴Acanthamoeba castellani的共生体，是人类罹患这种阿米巴疾病的偶见病原(34)。Simkanianegevensis是simkaniaceae的典型种类，与其他衣原体一样，也可导致人类感染(56，57，61)。

以前业已显示，衣原体不同种属间的RNase P RNA基因存在显著差异，可以作为诊断工具加以应用(13)；而且该基因在菌株分化中也特别有用。序列之间的差异也给我们提供了线索，可以发现分子的哪一部分是催化活性、互补突变和结构研究的重要部分。

另一族重要的病原体是分支杆菌，对于这类细菌，快速敏感的诊断方法是至关重要的。传统的诊断方法依赖于临床样本培养后显示出的抗酸杆菌特性。这虽然可靠，但非常费时，因为这些种类的细菌，如结核分支杆菌，生长非常缓慢，通常需要6-8周的时间才能形成足够大的菌落。在过去的几年中，发展了多种基于PCR的诊断方法，例如，基于hsp60基因(16)或16S与23S rRNA基因之间散布区(15，24，30)的PCR诊断方法，这一趋势还在继续。

已知结核分支杆菌(6)、牛分支杆菌和麻风分支杆菌的RNase PRNA基因序列。牛分支杆菌的序列与结核分支杆菌的序列相同，但与麻风分支杆菌的序列存在差异。RNase P RNA基因中通过其他方法显示的催化活性的重要区域，在分支杆菌间几乎完全保守。微生物种属间的密切关系，如分支杆菌，使同一种属不同种类的细菌区分变得异常艰难，甚至几乎不太可能。

发明简述

本发明解决了同一属如分支杆菌属和衣原体属中不同种的细菌区分问题。而且，本发明还解决了检测病原体的问题，这些病原体应用常规检测方法通常难以查到，或者费时费力。

本发明方法原则上可以用来诊断任何病原微生物导致的感染。病原体包括古细菌和真细菌。后者主要包括滑动细菌(gliding bacteria)，螺旋菌，僵硬细菌(rigid bacteria)和支原体。僵硬细菌包括放线菌类和简单的单细胞细菌。后者包括专性细胞内寄生虫和自由生活的细菌。在自由生活的变异体中包括(1)革兰阳性细菌，包括(a)球菌，(b)不形成孢子的杆菌，(c)形成孢子的杆菌，还可进一步分为专性需氧菌和专性厌氧菌；以及(2)革兰阴性细菌，包括(a)球菌，(b)非肠道杆菌，可以是螺旋型杆菌，也可以是棒状杆菌，(c)肠道杆菌，包括兼性厌氧菌、专性需氧菌和专性厌氧菌。欲了解更为详尽的细菌分类，可以参考Medical Microbiology，(Brooks et al，eds.，19^th ed.(1991)，Prentice-Hall International，USA)。