[发明专利]一种新型纤溶酶原激活剂(TPA)突变体的结构与用途

说明书

溶栓治疗是处理急性心肌梗塞的重大进展。组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogenactivator，TPA)是血中纤溶系统的生理性激活剂。由于TPA与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。TPA与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身之纤维蛋白溶解、疗效高等优点。由德国勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)生产的CHO细胞表达的重组人TPA(CHO-TPA，阿替普酶，alteplase，actilyse)已成功地用于急性心肌梗塞等血栓性疾病。但作为溶栓剂，TPA亦有不足之处。如在体内可被肝细胞快速清除，在血浆中存在纤溶酶原激活剂抑制剂可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1-5分钟)，使临床溶栓治疗时为维持有效浓度需大剂量(100mg)静脉滴注，增加了系统性纤溶引起出血的危险。因此研制特异性好、半衰期长、用量小、使用方便的新型t-PA受到关注。

TPA分子结构与其特定的功能特性有关。天然TPA由527个氨基酸组成(Pennica D，etal.Nature 301：214，1983)，指状区(F，氨基酸1-99)与高纤维蛋白结合有关；kringle 1区(K1，氨基酸100-175)为肝脏受体结合部位；kringle2区(K2，氨基酸176-261)为低纤维蛋白结合区；蛋白酶区(P，氨基酸262-527)对纤溶酶原有专一性，为PAI-1结合位点；碳水化物区为血浆清除TPA的介导物。几种新纤溶酶原激活剂都是在此发现基础上设计的。通过对天然组织型纤溶酶原激活剂(TPA)分子进行结构改造，开发出了组织型纤溶酶原激活剂重组变异体K2P、瑞替普酶(reteplase)、n-PA及TNK等。

Weldenstrom M等(Weldenstrom M，et al.Gene.99：243-248，1991)报道了TPA突变体K2P(氨基酸1-5和174-527，Asn177Ser和Asn184Gln)在肠杆菌中的表达。KohnertU等在TPA突变体K2P的基础上研制了瑞替普酶(Kohnert U，et al.Protein Engineering5：93，1992，专利号：EP 0 382 174 A1)。瑞替普酶是一含355个氨基酸的单链分子，在大肠杆菌中表达。它不具有碳水化物链、指状区、表皮生长因子区和kringle1区，只含有kringle2区和丝氨酸蛋白酶区(氨基酸1-3和176-527)，整个分子的性质因此大大改变。首先它与纤维蛋白的结合率远低于天然TPA，并且是可逆结合，未结合的瑞替普酶能进入血凝块，促进纤维蛋白溶解。其次，清除率较低，半衰期较长(18分钟)，从而降低了维持治疗水平所需要的药量(20-40mg)，并可通过静脉注射给药(2分钟内注入)。Martin等(Martin U，et al.JACC 19：433，1992)比较了瑞替普酶、阿替普酶(alteplase)、黑色素瘤TPA(melanoma TPA)和尿激酶的体外溶血块活性。结果表明，瑞替普酶和阿替普酶的最大溶栓能力在等价浓度时是相近的。Martin等的研究表明，与阿替普酶相比，瑞替普酶溶解富血小板血浆凝块和陈旧凝块的能力较低。这正是瑞替普酶减少出血的原因，因为封闭损伤血管壁的血凝块是陈旧血凝块。与阿替普酶不同，瑞替普酶主要通过肾脏清除。临床试验显示重组变异体瑞替普酶(reteplase)在60分钟时梗塞相关冠状动脉的总开放率和完全开放率优于阿替普酶，而安全性相当。基于瑞替普酶的上述优点，美国FDA在1998年批准了瑞替普酶上市。但瑞替普酶结构中仍包含有PAI-1结合位点，人体血液中的PAI-1能与其结合而抑制其活性。体外实验显示5U/ml的PAI-1可使5ng/ml的瑞替普酶失活。而有报道心肌梗塞等血栓病人血中PAI-1浓度高于正常人，所以必然降低瑞替普酶的效果，增加其用量。