[发明专利]利用转基因生菜生产人胰岛素的方法

说明书

本发明是利用生菜做为一种植物生物反应器来制造人胰岛素。这种人胰岛素可以通过生食生菜，做为一种口服制剂通过消化道上皮粘膜进入体内，改善糖尿病病人的自体免疫状况。同时也可以从这种生菜提取高表达量的人胰岛素，而获得注射用人胰岛素。

本发明的主要创新之点在于(1)选用植物偏爱的密码子，人工合成人胰岛素基因；(2)在合成人胰岛素的C端加上了KDEL内质网滞留序列，避免了胰岛素在植物细胞中的降解。

在植物生物反应器研究中利用马铃薯块茎生产乙肝疫苗的研究已受到广泛的重视。生菜做为可生食的蔬菜或果品，用它来生产口服的多肽类药物具有很大的应用潜力。人胰岛素对于胰岛素依赖的尿病患者的治疗是十分重要的。某些糖尿病患者的代谢调节与自体免疫功能相关。口服胰岛素已被证明对某些类型的尿病治疗是有效的〔Reddy S et at，Pancreas2000，20(1)：55-60；Ploix C et at，Diabetes 1999，48(1)2150-6；Ramiya VK，Maclaren NK，Horm Res 1997，48 suppl 4：67-70〕。

本项发明的技术要点之一是胰岛素基因的人工合成。之所以不采用天然人胰岛素的DNA序列，是因为我们采用植物偏爱的密码子可提高该基因在植物中的表达量。我们所用的人胰岛素基因编码了天然胰岛素A链和B链的氨基酸顺序，但DNA顺序与天然人胰岛素基因的DNA顺序并不相同。

本项发明的要点之二是植物表达载体pCAM35S-InsK的构建。将人工合成的人胰岛素基因InsK连接到p11Z载体上并测序，然后从pBI221载体上切下CaMV 35S启动子，置于胰岛素基因的上游。将CaMV 35S-InsK切下后置于植物表达载体pCAMBIA1390的nos终止子之前，经酶切和PCR鉴定证明载体构建正确。

本项发明的要点之三是在人胰岛素基因的C端加上了KDEL的内质网滞留序列。研究证明在蛋白质的C端加上KDEL的四个氨基酸序列，能够使该蛋白质滞留于内质网中，从而避免被大量降解。

本项发明的要点之四是农杆菌介导的生菜转化。将植物表达载体pCAM35S-InsK冻融法转入农杆菌LBA4404。农杆菌在含链霉素的YEB培养基中繁殖后与生菜叶片共培养，共培养的叶片在含Cb和潮霉素的筛选培养基上放置一段时间后出现愈伤组织，然后愈伤组织分化长出小苗，将小苗分别移入不同瓶中，经PCR鉴定阳性植株，并进一步Southern blotting和ELISA鉴定。

在本发明的一个实施方案中，关于人胰岛素基因的合成，选用植物偏爱的密码子。为此在人胰岛素A链63个碱基中更换了13个碱基。在B链90个碱基中更换了18个碱基，另外在3’端加上了12个碱基编码内质网滞留序列KDEL。在A链与B链之间我们设计了6个氨基酸的连接片段。此连接片段的氨基酸种类及顺序的设计原则是保持人胰岛素天然的三维结构特征。我们将人工合成的包含人胰岛素A链与B链及中间小段连接顺序克隆于pGEM-11Z载体中的EcoRI和BamHI位点，并经质粒酶切图谱的分析及序列分析加以确定，该质粒命名为p11Z-InsK。在这一实施方案中，人胰岛素基因片段可以通过PCR扩增得到，扩增时，使用的引物如下：InsK 5’：5’-GAT CCA TGT TCG TTA ACC AAC ACC-3’InsK 3’：5’-CTC GTC CTT GTT GCA GTA GTT CTC-3’。

在本发明的一个实施方案中，人胰岛素基因置于组成型表达启动子CaMV35S启动子的调控之下，再转入中间载体中。再进一步转入双元表达载体，完成一个植物表达载体的构建(见图1、人工合成的人胰岛素基因的克隆及植物表达载体的构建流程图。其中人胰岛素基因处于组成型启动子CaMV35S的控制下)。

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代号为p11Z-InsK，保藏编号为CGMCC NO.0723，保藏日期为2002年3月8日。一、合成人胰岛素基因InsK序列：1     GATCCATGTT CGTTAACCAA CACCTTTGCG GATCTCACCT TGTTGAGGCT CTTTACCTTG61    TTTGCGGAGA GAGGGGATTC TTCTACACCC CAAAGACCGG AGGACCATCT GGAGGAGGAA121   TCGTTGAGCA ATGCTGCACC TCTATCTGCT CTCTTTACCA ACTTGAGAAC TACTGCAACA181   AGGACGAGCT TTAAG