[发明专利]产L－半胱氨酸细菌及生产L－半胱氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产L-半胱氨酸的方法，更进一步说涉及一种新的适合于生产L-半胱氨酸的棒状杆菌及利用该细菌生产L-半胱氨酸的方法。L-半胱氨酸和L-半胱氨酸的衍生物可以用于药品领域、化妆品领域及食品领域。

背景技术

通常地，L-半胱氨酸是通过从含角蛋白的材料如毛发、角质物、羽毛提取得到，或利用DL-2-氨基二氢噻唑-4-羧酸作为母体经微生物酶转化而得到。另外，也有利用微生物发酵来生产L-半胱氨酸的。

关于细菌的L-半胱氨酸的生物合成已被详细的研究，所述细菌例如埃希氏大肠杆菌(Kredich，N.M.等，生化杂志(J.Biol.Chem.)241，4955-4965(1966)；Kredich，N.M.等，1987，半胱氨酸的生物合成，在Neidhardt，F.C.等编著的细胞及分子生物学中，第1卷，埃希氏大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿特区，419-428(Neidhardt，F.C.，et al.(eds)，Escherichia coli and Salmonellatyphimurium：Cellular and Molecular Biology，Vol.1，American Society forMicrobiology，Washington D.C.))，已经阐明L-半胱氨酸是由L-丝氨酸经过两步反应而产生的。在埃希氏大肠杆菌中，第一步反应是乙酰辅酶A对L-丝氨酸的活化反应，该反应是用丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.30，下文简称”SAT”)催化的，第二步反应是由上述反应生产的O-乙酰基丝氨酸生产L-半胱氨酸的反应，该反应是用O-乙酰基丝氨酸(硫羟基)裂解酶催化的。

而且，已经弄清楚，在埃希氏大肠杆菌中，L-半胱氨酸的降解会因为半胱氨酸脱巯基酶(下文简称“CD”)活性的降低而受到抑制(日本专利特开平No.11-155571)。

在埃希氏大肠杆菌中，编码SAT的基因(cysE)已经从野生菌和分泌L-半胱氨酸的突变菌中克隆出来(Denk，D.和Boeck，A.，普通微生物学(J.GeneralMicrobiol.)，133，515-525(1987))。而且这些cysE的核苷酸序列已经被测定，有报道表明在SAT中其第256位的甲硫氨酸残基被异亮氨酸残基所取代，L-半胱氨酸对其的反馈抑制作用是减弱的。此外，也有文章披露了用编码SAT的DNA来生产L-半胱氨酸及其类似物的方法，其中所用的SAT基因通过引入与上文不同的突变来减弱L-半胱氨酸的反馈抑制作用(国际公开号为WO97/15673)。这种SAT在第97位到第273位氨基酸区域内有一个突变，或者在第227位点的氨基酸之后有一C-末端区域的缺失。

尽管已知如上所述通过利用L-半胱氨酸对其反馈抑制作用被减弱的SAT的编码基因来生产L-半胱氨酸的技术，该申请的发明人发现，属于含有L-半胱氨酸对其的反馈抑制作用被减弱的SAT的这类埃希氏杆菌属的细菌L-半胱氨酸的产量并不稳定。但是他们还发现这种不稳定是能够被克服的，比如，通过降低细胞内CD的活性，能够使其产量变得稳定。他们还成功地获得了一种能够稳定地生产L-半胱氨酸的埃希氏大肠杆菌菌株(日本专利特开平NO.11-155571)。

进一步地，还披露了一种通过使用微生物，特别是埃希氏大肠杆菌，来生产L-半胱氨酸等物质的方法，其过量表达一种适合于从细胞中排出抗生素或其他有毒物质的某种蛋白的编码基因(排泄基因)(日本专利NO.29920110)。

另一方面，和对于谷氨酸棒状杆菌一样，aecD基因已经被证明为是使S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)具有抗性的基因(Rossol，I等，细菌杂志(J.Bacteriol.)，174(9)，2968-2977(1992))。已经明，aecD基因不是生长所必需的，只有在其扩增时在AEC抗性中涉及，这种基因所编码的蛋白质，在底物为AEC、半胱氨酸或其类似物时，具有C-S裂解酶活性。Rossol等人注意到这一事实，裂解酶能够催化消除反应，还能像合成酶一样催化反向合成反应，从而提出一种含硫氨基酸的新的酶促合成途径。但是，由于利用微生物发酵来生产含硫氨基酸的成功例子非常少见，因此他们只给出了一种，可能利用C-S裂解酶的反向反应的酶促合成方法。

如上所述，培养埃希氏杆菌属的L-半胱氨酸生产菌已有了很多报道，与谷氨酸棒状杆菌的L-半胱氨酸降解有关的酶也有了相当深度的报道，但是，尚无一例是关于利用棒状杆菌发酵到一定程度可以从培养基中收集L-半胱氨酸来生产L-半胱氨酸的。