[发明专利]耐高温胞嘧啶脱氨酶基因及其编码的多肽和制备方法

说明书

                          技术领域

本发明涉及突变或遗传工程，尤其涉及一种耐高温胞嘧啶脱氨酶基因序列及编码的多肽和制备方法。

                          背景技术

胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)在体内催化胞嘧啶水解脱氨生成尿嘧啶的反应。核苷酸的分解产物嘧啶碱可以在生物体内进一步被分解。不同种类的生物对嘧啶碱的分解过程也不完全一样。一般具有氨基的嘧啶需要先水解脱去氨基。

胞嘧啶脱氨酶属于多亚基酶的家族，它催化底物水解脱氨作用，生成相应的尿嘧啶产物。它们在嘧啶核苷的补救途径中发挥重要作用。它们广泛地分布在真核组织中，服从于变构和转录的调控，它们的转录在分化、维生素D₃和γ干扰素处理的情况下被诱导。

嘧啶的补救途径有两个不同的功能。一个是补救嘧啶的合成，另一个是降解生成可作为碳源和氮源的化合物。胞嘧啶、胞苷、和脱氧胞苷酸的脱氨酶都属于这个酶的家族，可以催化单核苷酸底物脱氨，都与细胞中的嘧啶核苷酸库的维持相关。它们催化不可逆转的胞嘧啶、胞苷、和脱氧胞苷酸以及几种它们的类似物的水解脱氨反应生成相应的尿嘧啶衍生物。基于这个家族的酶的蛋白质顺序的排列和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶的晶体结构，鉴定出了一个保守的活性位点。在这个活性位点上，有催化活性所必须的半胱氨酸、组氨酸、两个半胱氨酸残基和锌的附着。此外，谷氨酰胺残基与催化作用时的质子穿梭有关。

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶是一个有两个活性位点的同型二聚体，每一个亚基上有一个活性位点。它可将抗真菌药5-氟胞嘧啶脱氨基代谢为临床上常用的抗DNA合成化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)。

细菌Bacillus subtilis的胞嘧啶脱氨酶是一个含锌的酶，是一个同型四聚体，四个亚基完全相同，每一个亚基约14kDa，它可以催化2-脱氧胞嘧啶到2-脱氧尿嘧啶的反应。

人的胞嘧啶脱氨酶也是一个同型四聚体，每一个亚基约16.2kDa，每个上面都有一个活性位点。人的胞嘧啶脱氨酶是粒细胞和巨嗜细胞的一个有效的生长抑制因子，这可能是一个由胞嘧啶脱氨酶引发的受体介导的过程。由于这个酶消耗了细胞中的胞苷和脱氧胞苷库中的胞苷和脱氧胞苷的量，使DNA合成收到影响。胞嘧啶脱氨酶在几种抗肿瘤和抗病毒的胞苷酸类似物的代谢中起到很重要的作用，导致它们在药理学作用上的失活。胞嘧啶阿拉伯糖苷的脱氨作用是治疗癌症的最有用的化疗药剂之一。胞嘧啶脱氨酶及其相关的酶在细胞中的分布以前一直被认为细胞质中，而人的胞嘧啶脱氨酶被发现在核中存在。

癌症的化疗中有一种自杀基因疗法，它是通过将自杀基因转移至癌细胞内，其表达产物将无毒的前体药物转变成剧毒物质杀死癌细胞。目前使用最多的自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因。胞嘧啶脱氨酶能将无毒药物5-氟胞嘧啶转化为剧毒的5-氟尿嘧啶，TK能将一种叫GCV的无毒药物转化为剧毒的核酸类似物。

腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我国云南省腾冲县的热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌(eubacteria)，最适生长温度为75摄氏度，厌氧生长，革兰氏染色反应呈阳性。它由中国科学院微生物所首先发现并进行了分类学上的分析。菌种保存在中国微生物保存中心MB4^T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)。该嗜热厌氧菌是我国特有的一个物种，其体内所具有的耐高温胞嘧啶脱氨酶也具有自己特有的结构。

                         发明内容

本发明的目的之一是提供一种分离的，编码具有耐高温胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供一种分离的具有耐高温胞嘧啶脱氨酶活性多肽。

本发明的另一目的还提供了嗜热厌氧菌的胞嘧啶脱氨酶重组载体、含有重组载体的宿主细胞，以及制备蛋白的方法。

本发明一方面提供一种能编码具有耐高温胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的核苷酸序列。所说的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式，该修饰形式功能上相当或与胞嘧啶脱氨酶相关。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突变形式，突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。