[发明专利]耐高温葡聚糖磷酸化酶基因及其编码的多肽和制备方法

说明书

                         技术领域

本发明涉及遗传工程领域，具体地，涉及一种耐高温葡聚糖磷酸化酶基因及其编码的多肽及制备该多肽的方法。

                         背景技术

耐高温葡聚糖磷酸化酶(glucan phosphorylase)是聚葡聚糖(glucan)或称为聚葡萄糖分解过程所需的一种酶。其作用功能是催化下面所示的反应{(1，4)-α-D-葡萄糖残基}(N)+磷酸<＝>{(1，4)-α-D-葡萄糖残基}(N-1)+1-磷酸α-D-葡萄糖。

葡聚糖(glucan)或称为聚葡萄糖，是由重复的葡萄糖单位组成的我糖，键的连接方式有直链和支链两种，包括：纤维素、右旋糖酐、糖原、异麦芽糖、麦芽糖、淀粉和海藻糖。

耐高温葡聚糖磷酸化酶一个二聚体的蛋白质，它是由二个同样的分子量大约为90千道尔顿的亚基组成，同时每摩尔亚基含有1摩尔的5-磷酸吡哆醛是作为该酶所必需的活性位点的辅助因子。该酶共有530个氨基酸，其推测分子量为61386道尔顿。

在有磷酸盐存在条件下，磷酸化酶能降解淀粉或其他的a-葡聚糖变成被激活的葡糖基供体--1-磷酸a-D-葡萄糖，而该1-磷酸a-D-葡萄糖又反过来可以成为碳水化合物合成过程中几种酶的底物。因此，磷酸化酶对于来源于淀粉的碳水化合物的酶的合成方面具有潜在的用作。

α-1-4-D-葡聚糖磷酸化酶是一种淀粉磷酸化酶，它在生理上的作用是驱动淀粉多聚糖代谢。实践中，已有人在研究水稻的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶H的同功酶的应用。因此，葡聚糖磷酸化酶可在工业、农业方面有广泛的应用前景。本发明涉及的腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我国云南省腾冲县的热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌(eubacteria)，最适生长温度为75摄氏度，厌氧生长，革兰氏染色反应呈阳性。它是由中国科学院微生物所首先发现并进行了分类学上的分析。菌种保存在中国微生物保存中心MB4^T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)。该嗜热厌氧菌是我国特有的一个物种，其体内所具有的耐高温葡聚糖磷酸化酶也具有自己特有的结构。

                           发明内容

本发明的目的之一是提供一种分离的，编码具有耐高温葡聚糖磷酸化酶活性的多肽的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供一种分离的，具有耐高温葡聚糖磷酸化酶活性多肽。

本发明的目的还提供了含有编码耐高温葡聚糖磷酸化酶的DNA的重组载体、含有前述重组载体的宿主细胞，以及生产该蛋白的方法。

本发明的第一方面提供了一种编码具有耐高温葡聚糖磷酸化酶活性的多肽的核苷酸序列。该核苷酸序列能编码具有序列表SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式，该修饰形式功能上相当或与葡聚糖磷酸化酶相关。核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突变形式，突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

本发明的第二方面提供了一种耐高温葡聚糖磷酸化酶活性的多肽。该多肽具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本发明提供了生产耐高温葡聚糖磷酸化酶的方法，它包括以下步骤：

1)分离出核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的编码耐高温葡聚糖磷酸化酶的基因：

2)构建含有如步骤1)所述的基因的核苷酸序列的表达载体；

3)将步骤2)中表达载体转入宿主细胞，形成能生产耐高温葡聚糖磷酸化酶的重组细胞；

4)培养步骤3)中的重组细胞；

5)分离、纯化得到耐高温葡聚糖磷酸化酶。

本发明涉及嗜热厌氧菌的葡聚糖磷酸化酶基因的分离及表达。以腾冲嗜热厌氧菌全基因组测序与分析为基础，克隆分离了耐高温葡聚糖磷酸化酶基因。运用该基因生产耐高温葡聚糖磷酸化酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶。另外，本发明还提供了具有耐高温葡聚糖磷酸化酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同体。同时，本发明还提供了制备，分离，纯化具有耐高温葡聚糖磷酸化酶活性的多肽的方法。

                         附图说明

图1是测序文库构建步骤流程图；

图2是测序与数据分析流程图。