[发明专利]亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因及其编码的多肽和制备方法

说明书

                    技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及亚非马蜂蜂毒溶血肽前体(Prepromelittin)基因及其编码的多肽和制备方法。

                    背景技术

意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒溶血肽(Melittin)是意大利蜜蜂蜂毒的基本组成成分，约占蜂毒的40％～50％(Vol.3.New York：Academic，1971，535)，按来源和生化性质，它是一种活性多肽，其中90％的溶血肽以游离状态存在，而另外的10％则以Melittin N1-甲酰化形式存在(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1967，27：275-280)。它具有非常重要的生物学活性，能引起红细胞溶解(Z.Physiol.Chem.，1970，351，884)、脂质体释放标记离子(marker ions)(J.Biol.Chem.，1969，244，3575)以及肥大细胞释放组胺(J.Pharmacol，1965，25，29)等等。Melittin合成时有两种前体存在。一种是Promelittin，在蜜蜂毒腺或注入蜂王毒腺提取物的蛙卵中发现。在蛙卵中合成时，Promelittin是稳定的终产物，而在毒腺中，它将缓慢地转变为Melittin；第二种称为Prepromelittin，分子量比Promelittin大，只能在无细胞体系中转录的Melittin mRNA上发现(Proc.Natl.Acad.Sct.USA，1978，75，701-704)。

1983年，Vlasak等利用意大利蜜蜂蜂王毒腺总RNA反转录成cDNA，然后将合成的双链cDNA克隆到pBR322载体中，构建cDNA文库，用探针筛选出带有大于200bp插入片段的阳性克隆，然后再将它们亚克隆到PUC8载体中，再经酶切鉴定从中筛选出2个阳性克隆，对其中含有最大插入片段的PUM13/4进行测序，结果显示该插入序列为Prepromelittin的核苷酸序列，该cDNA所编码的成熟肽--蜂毒溶血肽前体蛋白为49个氨基酸残基(Eur.J.Biochem.，1983，135：123-126)。Prepromelittin蛋白实质上是蜂毒溶血肽的天然融合蛋白，它在蜜蜂毒腺细胞中合成后经二肽蛋白酶水解成蜂毒Melittin。

                        发明内容

本发明目的之一是提供一种亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的一个同系物。本发明目的之二是提供一种由亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多核苷酸编码的最终产物--亚非马蜂蜂毒Melittin蛋白。

本发明目的还提供了这种制备亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸探针、含亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸和Prepromelittin基因末端的130-213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。

在本发明，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严格条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列。

在本发明还提供了一种分离的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白活性多肽，它包括：具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6序列的多肽。本发明还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。

本发明还提供了一种制备具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白的活性多肽的方法，该方法包括：