[发明专利]雷公藤再生植株及其制备工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种雷公藤再生植株及其制备工艺。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook f.)为卫矛科雷公藤属植物。药理实验表明，雷公藤具有明显的抗肿瘤、抗炎、免疫抑制以及抗生育作用。目前的研究结果表明，雷公藤二萜内酯类化合物是其主要的有效成分。雷公藤化学成分复杂，药理作用广泛，有重要的临床应用价值。

但由于雷公藤为多年生木质藤本，生长缓慢，临床上大量应用，造成野生资源严重贫乏。因此，雷公藤的人工培育对缓减资源紧张局面、保护生物的多态性、满足人民医疗需要及出口创汇等起着责无旁贷的作用。

目前，对于雷公藤人工培育技术的研究主要集中在利用野生雷公藤的幼茎、叶作外植体进行愈伤组织诱导和细胞悬浮培养。然而，这些技术还存在不足之处：

1.愈伤组织或悬浮细胞属未分化型培养物，而野生雷公藤均用植株作药材，其属于分化型产物，二者存在本质上的差异。

2.愈伤组织或悬浮细胞的培养得率较低，难以大规模培养用于产业化。

3.愈伤组织或悬浮细胞在长期继代培养中易发生遗传变异，导致培养物的有效成分不稳定。

所以，如何开发一种既能大规模生产、又能保持有效成分相对稳定的人工培养技术，一直是研究人员所追求的目标。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种雷公藤再生植株，它繁殖系数高，其有效成分的含量比野生雷公藤的高，而且能够保持有效成分含量相对稳定。

本发明的另一个目的，在于提供一种繁殖系数和有效成分含量高的雷公藤再生植株的制备工艺，主要是利用细胞变异和细胞全能性的科学原理，改变其生长缓慢和有效成分含量低的特性，并在再生植株中稳定表达。

本发明提供的制备雷公藤再生植株的方法，是根据细胞全能性的原理，植株的每一个离体细胞可以在适宜的培养条件下生长发育成与母体完全一样的植株，以及细胞变异原理，即细胞或愈伤组织在离体培养过程中会发生无性系变异，对离体培养细胞或愈伤组织给予诱变或染色体加倍处理，可以增加变异范围和提高变异频率。因此，我们首先对雷公藤细胞或愈伤组织进行诱变或染色体加倍处理引发大量变异。

取野生雷公藤或种子苗，用其幼嫩组织作为外植体，经表面灭菌15～20分钟，切成薄片，置于无菌诱导培养基内，经35～45天左右的培养，培养温度22～25℃，获得愈伤组织。然后进行2～3次继代培养，每代培养25～30天，培养温度22～25℃，得到大量愈伤组织。大量愈伤组织置入液体培养基，在摇床上培养25～30天，培养温度22～25℃，转速为110～125转/分，形成悬浮培养细胞或细胞团。

无菌条件下将安全低毒诱变剂或染色体加倍剂与悬浮培养细胞或细胞团共培养12～24小时。然后用无菌水洗去诱变剂或加倍剂，将悬浮细胞或细胞团置入修复培养基中浅层培养9～12天左右，培养温度22～25℃。此步骤可以由3～4代的继代培养代替。

然后将上述的悬浮培养细胞或细胞团置于分化培养基上培养，每天光照10～12小时，培养温度22～25℃。25～30天后从各种再生物中选择正常型再生苗。再生苗置于增殖培养基上形成再生植株。

选择繁殖系数高且粗壮的再生植株，取其一部分植株进行总二萜内酯含量的测定，然后再对总二萜内酯含量高的进行雷公藤内酯醇含量的测定。总二萜内酯含量测定采用间二硝基苯比色法，雷公藤内酯醇含量的测定采用高效液相色谱法。经含量测定后从中选择有效成分含量比野生雷公藤高的再生植株。上述有益变异可以通过无性繁殖途径保留和稳定的遗传下去。

由于变异细胞或变异体在发生主要变异时还会发生相连或不相连的其他变异，以及再生植株易对驯化条件产生适应性反应的特性，因此将再生植株茎尖依次置于激素(如6-苄基氨基嘌呤)浓度从高到低再到零的驯化培养基上，22～25℃每天10～12小时光照，每次培养25～30天。最后从无激素简单培养基上选择生长速度快、有效成分含量高的植株。或者也可以将再生植株直接置于无激素培养基上进行驯服培养。

将驯化型再生植株置于简单培养基上，22～25℃培养，每天10～12小时光照(如用日光灯)，每代可增殖5～6倍。按照上述方法，对每代植株进行总二萜内酯含量和雷公藤内酯醇含量的测定检测其有效成分及其含量的稳定性，其中雷公藤内脂醇的含量基本保持在0.009-0.015％之间。