[发明专利]耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶基因及其编码的多肽和制备方法

说明书

                         技术领域

本发明涉及突变或遗传工程，尤其涉及一种耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶基因及其编码的多肽和制备方法。

                         背景技术

Phosphoribosylanthranilate isomerase(PRAI)，E.C.5.3.1.24，中文名称为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶。此酶催化色氨酸生物合成的第四步反应，即将5′-磷酸核糖基邻氨基苯甲酸转变为1-(o-羧苯氨基)-1-脱氧核酮糖5-磷酸(CdRP)。

在大多数的嗜热微生物中是单体的，也是不稳定的。但是在嗜热菌Thermotoga maritima中它是二聚体和稳定的(tPRAI)。tPRAI的两个亚基是背靠背的由一个疏水的环连在一起。合理设计的tPRAI单体变异体已经测到二聚作用对于热稳定性。

嗜热微生物的新陈代谢可以在接近100摄氏度的条件下正常进行，这是由于它们有热稳定酶和处理不稳定代谢物的机制。蛋白质的热稳定性的结构基础具有重要的科研价值。来自于嗜热微生物同源蛋白的X射线衍射结构的不同可以看出起关键作用的稳定交互作用。为了达到这个目的，Hennig M等人利用同型代换的方法得到的噬菌体研究了Thermotoga maritima的磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(tPRAI)二聚体的晶体结构，得到的精度可达2.0。tPRAI的亚基是完全的TIM-或者(βα)8-barrel的折叠，而大肠杆菌ePRAI的α螺旋被一个环所取代。tPRAI的亚基之间通过它们中心beta-barrels的氮端的面相连。两个长的相互对称的在其他亚基的空穴中反向突出的环有助于多疏水作用。在tPRAI中，氮端甲硫氨酸的边链和两个亚基的碳端的异亮氨酸被固定在一个疏水簇中，盐桥的数量也有所升高。这些特征似乎是tPRAI的高热稳定性的主要原因。与其他的超热稳定酶相比，tPRAI在25℃时的催化作用比ePRAI效率高，这主要是因为它底物的米氏常数值低。

拟南芥色氨酸的生物合成途径中的这个酶是由一个基因家族编码的。He Y等人观察了每一个PRAI的同工基因的表达模式。结果表明，三个同工基因在正常的生长条件下是分别受到调控的。第一，PRAI1和PRAI3的表达量比PRAI2大约高10倍；第二，三个同工基因对环境压力的反应是不同的，PRAI2对压力的反应比另两个更强；第三，这三个基因的表达具有组织和细胞特异性；第四，PRAI同工基因的表达是与拟南芥的正常生长和发展相协调的。

腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我国云南省腾冲县的热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌(eubacteria)，最适生长温度为75摄氏度，厌氧生长，革兰氏染色反应呈阳性。它由中国科学院微生物所首先发现并进行了分类学上的分析。菌种保存在中国微生物保存中心MB4^T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)。该嗜热厌氧菌是我国特有的一个物种，其体内所具有的耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶也具有自己特有的结构。

                         发明内容

本发明的目的之一是提供一种分离的，编码具有耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶活性的多肽的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供一种分离的具有耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶活性多肽。

本发明的另一目的还提供了嗜热厌氧菌的磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶重组载体、含有重组载体的宿主细胞，以及制备蛋白的方法。

本发明一方面提供一种能编码具有耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶活性的多肽的核苷酸序列。所说的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式，该修饰形式功能上相当或与磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶相关。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突变形式，突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

本发明另一方面提供了一种耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶活性的多肽。该多肽具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本发明它提供了制备耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的方法包括以下步骤：

1)分离出编码耐高温磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的核苷酸序列SEQ IDNO.1；