[发明专利]白细胞介素－2基因在慢性疼痛应用中的测试方法

说明书

技术领域：

本发明属基因工程技术领域。具体涉及一种白细胞介素-2(IL-2)基因在慢性疼痛应用中的测试方法。

背景技术：

疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验。许多疾病和损伤可导致持续性的剧烈疼痛，给患者带来极大的痛苦，甚至产生“痛不欲生”的厌世之感，这种“慢性痛”是医学界长期努力但至今仍未解决的难题，现有的治疗方法存在着难以接受的副作用，或有一定的侵害性。如神经损伤引起的神经病理痛难以被现有的方法控制，口服或静脉注射吗啡治疗癌症痛仅有部分疗效，且伴有便秘、镇静、呼吸抑制等副作用，而且它的实际应用常常由于成瘾性而受限。为了减少副作用，将导管埋入蛛网膜下腔，用灌注泵局部给予阿片剂镇痛，但价格昂贵，并有感染的危险。蛛网膜下腔移植转基因细胞治疗疼痛虽已被尝试，但植入的细胞可能堵塞脑脊液循环。现在临床迫切需要高效且副作用少的治疗药物和方法。

基因治疗为解决这一问题带来了新的希望，它是一种通过基因转移的方法将具有表达功能的基因导入到相关的细胞和组织中，使转录和翻译的产物发挥治疗作用的方法。目前用于在体(in vivo)基因治疗的基因转移方法包括病毒载体介导和非病毒转基因方法。其中质粒介导的转基因方法安全性好，可用于在体基因治疗，但表达不持久。腺病毒载体稳定性好，转基因效率高，可转染分裂或不分裂细胞；腺病毒进入细胞核后，以附加体(episome)的形式存在，不发生整合，因此没有逆转录病毒载体潜在的致癌、致突变性，安全性较好，这些特点决定了腺病毒非常适合于神经系统的在体基因治疗。当腺病毒载体注入蛛网膜下腔后，腺病毒进入软脊膜和蛛网膜内增殖，基因表达产物以“旁分泌模式”作用于脊髓和感觉神经根，可在脊髓水平进行疼痛控制，这种疼痛的基因治疗方式通过腰穿即可完成，所以有希望应用于门诊患者的治疗。

白细胞介素-2是一种重要的免疫调节物质。刘新垣院士等首先发现IL-2具有镇痛作用，实验表明IL-2既有中枢镇痛作用又有外周镇痛作用。临床观察发现对吗啡都无效的晚期癌症痛患者，使用IL-2后仍然具有很好的镇痛作用。实验还发现IL-2的镇痛作用可能与阿片受体有关。然而，在外周镇痛作用研究中，发现阿片受体拮抗剂只能部分阻断IL-2的镇痛作用，说明IL-2的镇痛作用可能由阿片受体在内的多种受体介导。在吗啡耐受及对吗啡不敏感的神经病理痛模型上，IL-2较吗啡具有更为有效的镇痛作用，推测IL-2的镇痛作用具有广阔的临床应用前景，可望用于较为棘手的神经病理痛的治疗。然而IL-2在机体内活性半衰期很短，必须大剂量连续用药，一则医药费用高，再则机体难以忍受长期注射，从而影响了治疗效果及这一药物的广泛应用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是开发白细胞介素-2基因在慢性疼痛应用中的测试方法，该方法包括下列步骤：(1)pcDNA3-IL-2真核表达质粒的构建

人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长的含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pcDNA3载体。IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化。通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度。注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸盐缓冲液(PBS)中。(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建

人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长的含信号肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入经相同酶切的pCA13载体。IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒。扩增纯化后的腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的PBS中。(3) 慢性神经病理痛模型的建立

SD雄性大鼠(240-260g)由中国科学院上海实验动物中心提供，大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)建立慢性神经病理痛。(4) 外周炎症痛模型的建立

SD雄性大鼠(240-260g)由中国科学院上海实验动物中心提供，大鼠后肢跖部皮下注射角叉菜胶(Carrageenan)建立外周炎症痛模型。(5)pcDNA3质粒介导IL-2基因对慢性神经病理痛的影响