[发明专利]胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用，涉及的是利用现代生物技术分离提取制备胚胎优质超剂量造血干、祖细胞及其方法，它可应用于临床造血干、祖细胞移植，治疗相关的血液病、遗传病肿瘤以及放化疗引起的免疫功能损伤等的一种生物制品。

背景技术

临床造血干、祖细胞移植，起始于成体骨髓移植。由外科手术从供者骨髓中抽取骨髓，这对供者造成的创伤是一般人难以承受的，加之，成体骨髓中的造血干、祖细胞抗原表达充分，分化、分裂处于后期(卵黄囊-胎肝-脾-胎骨髓-成骨髓)，相比较而言，造血干、祖细胞的质量较差，CD34⁺CD38^-在CD34⁺细胞中的相对含量较低。随着科技的进步和发展，发现脐血中的造血干、祖细胞也可用于临床造血干、祖细胞的移植，它与成骨髓中的造血干、祖细胞相比，其发育、分化较早，抗原表达较弱，CD34⁺CD38^-在CD34⁺细胞中的相对含量比成骨髓中的高，HLA配型要求比成骨髓低，但同一份脐血中的相对造血干、祖细胞总数较少，很难满足成人造血干、祖细胞移植数量的需要，因此在临床应用中有很大的局限性。不同脐血混合使用，数量虽能增加，但因基因型、血型、HLA抗原组合的不同，其质量大受影响，很难在临床上广泛使用。在体外培养条件下，通过干细胞生长因子的刺激使造血干、祖细胞扩增，虽能使细胞扩增数十倍至数万倍，但无一例能在体内重建长期造血功能。现已发现，现有技术扩增的仅是祖细胞而不是干细胞。所以目前体外扩增仍处在研究阶段，还不能用于临床。为了增加造血干、祖细胞的数量，借助于休外造血干、祖细胞扩增的技术，将造血干细胞生长因子注射体内，促使体内骨髓造血干、祖细胞分裂扩增再从外周血中分离提取造血干、祖细胞，虽能获得大量造血干祖细胞，但质量没有脐血造血干、祖细胞的质量高，此外外周血成熟的T细胞含量较多，移植物抗宿主病(GVHD)发生率高且程度较重。从胚胎的胎肝中提取干、祖细胞应用于临床，在20世纪80至年代国内外学者分别作出尝试，他们都是从16-22周的胎儿胎肝中获取造血干、祖细胞用于临床细胞移植，但是此时期中的造血干、祖细胞相对总数较少，很难满足超剂量的数量要求；此外由于发育屏障，异基因胎肝中的造血干、祖细胞很难在受体骨髓中归巢，因为微环境差异较大，所以成功率较低。

发明内容

本发明目的，针对上述不足之处提供一种优质超计量胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用.本研究发现的一种22周以上胚胎中的优质超剂量造血干、祖细胞，它能替代上述的成骨髓造血干、祖细胞，成体外周血中的干、祖细胞，脐血中的造血干、祖细胞和16-22周胎肝中的造血干、祖细胞。并可用于临床造血干、祖细胞移植。

胚胎发育的早期，胎骨髓尚无造血功能，在胚胎发育过程中逐渐形成造血功能，并逐渐增强最终代替肝脏造血，胎龄在22周前胎骨髓造血干、祖细胞的相对总数较少，其临床意义不大，22周后随着胎龄的增加，胎骨髓中造血干、祖细胞相对总数和胎肝中的造血干、祖细胞数都相应的增加。脾脏相对于肝脏而言重量较轻，体积较小，造血干、祖细胞相对总数较少，可分离提取，亦可忽略不记。

胚胎造血干、祖细胞悬液是由胎龄为22周以上的胎骨髓造血干、祖细胞悬液和胎肝造血干、祖细胞悬液两部分构成。

胚胎造血干、祖细胞制备方法：

将孕妇水囊引产自愿捐赠并经公证的死胎娩出后，置于0°-10℃保存；1-16h内送至实验室；在无菌条件下先从胎心中抗凝抽取胎血标本，供血型和HLA抗原检测，然后分别解剖取出相关胎骨(股、肱、胫、腓、桡、尺等骨)、胎肝，置于培养液中，0-10℃保存。

A、胎骨髓造血干、祖细胞悬液的制备：

(1)用骨钳、骨剪和解剖刀剪将胎骨去骨膜和两端的软骨；

(2)用吸有抗凝剂的培养液注射器，将针头分别插入两端的骨疏松质中，加压将骨髓冲至收集瓶中；

(3)用骨剪从长骨的中段剪断，并将注射器针头插至骨髓腔中反向加压冲洗，直至骨质中的骨髓细胞基本冲出为止，冲洗培养液约为20-80ml，视其胎龄大小而定；

(4)将收集瓶中的骨髓细胞悬液，经300-500目筛网过滤；

(5)计量骨髓细胞悬液原液；

(6)取上述适量骨髓细胞原液，经红细胞裂解在显微镜下统计有核细胞相对总数；

(7)经苔酚蓝染色统计死活细胞比例；