[发明专利]萝卜几丁质结合蛋白及其制备方法

说明书

本发明涉及几丁质结合蛋白，尤其涉及萝卜几丁质结合蛋白的制备。

几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质，现已发现几丁质结合蛋白广泛存在于动植物微生物中，其中几丁质酶和溶菌酶占有重要的地位，它们在植物防卫反应体系中发挥重要作用。因此研究比较多，陈崇顺、徐凤彩1993年，发现21科41种(变种)植物中具有几丁质酶，并比较了它们的酶活力。植物溶菌酶发现较早，自从1922年Fleming发现植物的根和花含有溶菌酶以来，先后从不同植物、植物的不同组织中发现了溶菌酶。但是，从植物中分离出既具有溶菌酶活力又具有几丁质酶活力的几丁质结合蛋白M₁、M₂和具有几丁质酶活力的几丁质结合蛋白M₃、M₄仍未见报导。

溶菌酶普遍用于食品行业的杀菌、防腐和保鲜，在发酵工业和生物工程的菌体破裂，在医药上用于临床治疗和诊断，国外利用溶菌酶制成药物，用于治疗出血、血尿、血痰、慢性鼻窦炎和副鼻窦炎、预防龋齿等疾病，以及白血病、肺结核、肾功能衰竭等疾病的临床诊断。溶菌酶的应用越来越广泛，国内的溶菌酶生产远未能满足国内市场需要，部分溶菌酶及其制剂需要进口。

目前市售的溶菌酶，主要以鸡蛋清为原料制备的，其制备技术复杂、原料成本高、产品酶活力低，鸡蛋来源有限，且与食品争原料。用鸡蛋清制取的溶菌酶只对G⁺菌有杀灭作用，而对G^-菌、真菌不起作用。

几丁质酶能水解真菌、酵母和昆虫细胞壁成分中的几丁质，从而杀之。

而作为生产应用的几丁结合蛋白M₁、M₂和作为生产应用的几丁质结蛋白M₃和M₄仍未有报导。

目前无论在医药上，还是农作物保护上以酶制剂制成的防治真菌药物极少。如水稻100多种病害，其中90％以上是由真菌引起的。因此，随着食品、医药和植保上高新技术的发展，寻找新酶源和新酶种势在必行。

我们研究中发现萝卜中几丁质结合蛋白含量最高。从而发现了萝卜几丁质结合蛋白(中文名为萝卜几丁质结合蛋白，汉语拼音为Luobo ji ding zhi jie he dan bai；英文名为Raphanuns SativusChitin-binding protein，缩写R·CBP)。经提纯得萝卜几丁质结合蛋白，这种萝卜几丁质结合蛋白含有四种蛋白质成分，我们叫它为M₁、M₂、M₃、M₄。

本发明目的在于寻找一种溶菌广谱、稳定性好、制备简便、应用效果好及应用范围广的酶制剂，开拓了新的酶制剂来源。萝卜几丁质结合蛋白的特性特征：

萝卜几丁质结合蛋白包含蛋白质M₁、蛋白质M₂、蛋白质M₃、蛋白质M₄，几丁质结合蛋白是蛋白质M₁、M₂、M₃、M₄的总称。它的共同特征在于：都为白色粉末，无毒、无味，易溶于水。其水溶液可达电泳纯(SDS-PAGE)。具有蛋白质结构和性质。固体制品的灰分：常规法测定≤5％，水分：恒重法测定期≤7％。M₁和M₂既具有溶菌酶活性，又具有几丁质酶活力，是双功能酶；M₃、M₄具有的几丁质含内切酶和外切酶活力。萝卜几丁质结合蛋白氨基酸组成如表1。