[发明专利]双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法。

背景技术

石英晶体微天平(QCM)又称压电传感器，其理论基础是基于压电效应。压电DNA生物传感器的原理是：先在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后设法让石英晶振选择性的吸附DNA，通过DNA分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的DNA进行识别，结合成双链DNA，利用频率变化反映杂交情况。由于QCM能对增加在表面的纳克级的质量有频率响应，因而是一种非常敏感的质量检测装置，适于检测单链DNA(ssDNA)在杂交前后质量的改变，从而可应用与DNA生物传感器的研究。QCM与电化学技术联用构成了电化学石英晶体微天平(EQCM)。它既具有QCM的高质量灵敏度，可以进行纳克级质量测定；同时又可获得电化学信息，现场测定电极表面的微小变化。

近年来应用电化学石英晶体微天平作为生物传感器发展迅速，在核酸分子杂交识别和测定方面已经显示出了巨大潜力，具有广阔的应用前景，目前对于EQCM生物传感器的研究常只利用质量方面信号，为QCM生物传感器。虽然QCM是一种灵敏的质量检测器，可测得亚纳克级质量变化，但在实际检测中，DNA的浓度远远低于QCM直接检测的范围，特别是作为检测超痕量变化的生物传感器，其灵敏度还不能达到要求。

发明内容

本发明就是针对上述问题提供一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，这种方法可检测超痕量的目标DNA，且灵敏度高。

本发明提供的技术方案是：一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后让石英晶振选择性地吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA，其特殊之处是：将标记有能与DNA双链选择作用且具有电化学活性的化学药物或生物试剂标记纳米微珠对检测信号作质量和电化学双重放大，然后进行质量信号检测和电化学信号测定。

上述纳米微珠为磁性微珠或白蛋白微珠。

上述能与DNA双链选择作用且具有电化学活性的化学药物为阿霉素类药物。

上述能与DNA双链选择作用且具有电化学活性的生物试剂为放线菌素D。

上述石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液10～60分钟，然后超声清洗1～3分钟，再用重蒸水洗涤3～5次，晾干。

本发明以能与双链DNA选择性作用且具有电化学活性的药物或生物试剂作为导向分子修饰在纳米微珠上，导向分子标记的纳米微珠与修饰在EQCM电极上的ds-DNA相互作用，因为纳米微珠的大质量，药物或生物导向分子和EQCM电极上的ds-DNA相互作用引起大幅度频率变化。这种方法可使最低检测下限从10^-8mol/L数量级下降到10^-13mol/L数量级。同时因为纳米微珠大的表面积，增大了导向分子在电极上的数量，在电化学测定时电化学信号大大地增强，从而通过电化学石英晶体微天平(EQCM)生物传感器技术从质量和电化学信号两方面相互映证、识别和放大测定目标DNA，进而双方面提高灵敏度。与常规的压电DNA生物传感器相比，本发明可使最低检测限改善2～5个数量级，因而不仅可检测超痕量的目标DNA，且选择性强、灵敏度高。

具体实施方式

实施例1：以阿霉素(ADM)修饰的纳米磁性微球对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。

一、阿霉素修饰的磁性微球的制备：配制2.0×10^-6mol/L阿霉素的水溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基磁性微球(可用市售产品)后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，微球在磁力架上用重蒸馏水清洗3次，加入0.5mL的重蒸水，4℃保存备用。

二、自组装α-硫辛酸单层膜：石英晶片使用前先浸入到无水甲醇溶液30分钟，然后超声清洗1分钟，再用重蒸水洗涤3次，空气中晾干。将洗涤干净的石英晶片迅速置于QCM的Teflon反应池，加入0.5毫升0.3mol/L α-硫辛酸的乙醇溶液，2小时后用重蒸水洗涤，空气中晾干。