[发明专利]一种新型脂肪酶抑制剂

说明书

肥胖是一种世界范围的常见病，随着经济发展和生活水平的不断提高，发病率日益上升。肥胖能引起多种代谢异常，是糖尿病与心血管疾病的主要危险因素之一，并与心血管疾患的发病率与死亡率增高有关。传统上基于饮食和运动对肥胖症的非药物治疗的长期疗效往往十分有限。在药物治疗中，中药制剂目前尚无疗效确切的品种，国外的芬氟拉明与右旋芬氟拉明因出现超声心动图下可见的瓣膜病变，该两药已于1997年撤出市场。1998年问世的食欲抑制剂西布曲明(sibutramine)是5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取的抑制剂，它主要作用于神经系统，使人产生厌食，从而通过减少营养来达到减肥目的。该药可能引起患者血压升高、心率加快，且不能应用于具有冠心病、心率失常和卒中等病史的患者中，而使该药的应用受到了限制(Stone NJ et al.Med Clin North Am，2000，84：95～102)。肥胖的发生，除肥胖基因(Ob)基因的调控之外，主要是脂肪酶的作用。特别是胰脂肪酶，作用部位在胃肠道。该酶可以先将摄入的脂肪乳化成极小的脂肪球，然后将其转化成游离脂肪酸和甘油三油酸酯，它们与胆盐相结合，形成胶束，胶束穿透肠壁细胞膜，摄入体内堆积成脂肪组织。本发明的脂肪酶抑制剂可以抑制脂肪酶的活性，使脂肪不转化、吸收，直接从粪便中排出。它是一种新型减少营养吸收剂，作用于胃肠道，为胰腺酶和其他脂肪酶抑制剂，主要阻止脂肪酶的催化分解，抑制由饮食摄入的1/3的脂肪吸收。适用于肥胖症，包括健康肥胖者及有II型(非胰岛素依赖性)糖尿病的肥胖者。

本发明的新颖性在于①一种具有高度选择性、长效的胃肠道脂肪酶抑制剂，与胃和胰腺中脂肪酶活性位点的丝氨酸残基共价键合，从而阻断脂肪和水的吸收，不影响神经系统和胃肠道的其他酶活性。②该脂肪酶抑制剂是由链霉菌属微生物经诱变育种，发酵产生的次生代谢产物，为一种脂肪酶的抑制剂，而非化学合成化合物。③该种脂肪酶抑制剂与其他减肥药不同，它不作用于神经系统，对心血管无不良影响。④该酶作用于胃肠道，但不被胃肠道吸收。本发明的脂肪酶抑制剂是通过抑制脂肪酶活性达到减肥的目的。

实施例

1、菌种

出发菌株为由土壤中分离的链霉菌属的丁香链霉菌(Streptomvcessyringae)，经紫外线诱变育种，得到的高产变异菌株作为出发菌种，保存在琼脂斜面培养基上。琼脂斜面培养基的成分为：可溶性淀粉10g，KNO₃2g，NaCl 2g，K₂HPO₄·7H₂O，MgSO₄·7H₂O 50mg，CaCO₃ 20mg，FeSO₄·7H₂O 10mg，琼脂20g，蒸馏水加至1L，pH7.0。

2、摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基成分为：脱脂大豆粉10g，甘油10g，酵母浸膏5g，加水至1L，调pH7.0。灭菌后，取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞后再次灭菌。用铂环接种Streptomvces syringae斜面菌种的孢子，28℃下通气培养24h。

3、二级种子培养

将摇瓶种子培养基100ml接种至装有25L生产培养基的50L发酵罐内。生产培养基的成分为：每升含脱脂大豆粉32g，甘油20g，蛋白胨2g，核糖10g，(NH₄)₂SO₄ 2g，聚乙二醇0.25ml(作为消泡剂)，调pH7.4，28℃下培养72h，通气量0.5vvm。

4、中试发酵培养

将25L二级种子培养基转入装有500L生产培养基的1吨发酵罐内，于28℃下，通气量0.5vvm，发酵96h。放罐后使发酵液冷却至2℃，离心收集菌丝体，于-20℃下冷冻保存。

5、粗提

菌丝体于4℃下融化，加2倍量甲醇机械磨碎匀浆处理30min，抽滤，滤饼再用等量甲醇匀浆30min，抽滤，合并滤液。使之浓缩至原体积的1/3，加1倍量水稀释。然后用等量的己烷-乙酸乙酯(1∶1)提取3次(第2次和第3次提取时各用NaCl破乳化)，最后用乙酸乙酯提取。合并有机提取液，减压浓缩，通过无水硫酸钠干燥，真空干燥，得浅棕色油状物，为粗品I。

6、3步层析纯化