[发明专利]烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法

说明书

                           技术领域

本发明涉及一种壳聚糖衍生物非病毒转基因载体的制备方法。属于基因治疗领域新型高效非病毒载体的制备方法和技术。

                           背景技术

转基因技术在生物、医药、环保等领域发挥着越来越重要的作用，一批批转基因动物和植物相继产生，已成为科学研究中新的亮点。目前基因转染主要采用显微注射、病毒载体、非病毒载体转化等方法，它们都存在容易造成DNA损伤、转染效率低、设备昂贵、需要高超的操作技能等缺点，制约着该技术的更广泛的应用。基因转染的核心问题和关键步骤是如何稳定、高效、无损伤的将外源基因导入目标细胞。但是，由于DNA和细胞膜表面均带负电，静电排斥作用阻碍了基因的进入。为了提高基因的转染率，研究人员尝试利用病毒和非病毒载体将基因“输送”至宿主细胞。尽管病毒载体可获得很高的转染率，但其缺点是易引起免疫反应和肿瘤化趋势。鉴于此，对非病毒载体的研发日益引起了广泛的关注，如脂质体、聚赖氨酸、二乙基氨基葡聚糖、树状高分子等，这些非病毒载体通过静电相互作用同DNA形成聚电解质复合物(PEC)，复合方法简便易行，并使包覆的DNA得到保护，但研究表明所开发的非病毒载体的转染率尚较低，且很多合成高分子非病毒载体存在较明显的细胞毒性。

壳聚糖是一种生物相容性良好、可降解、无细胞毒的天然碱性多糖，几十年来，壳聚糖广泛用于药物缓释剂、止血材料、组织工程支架、降固醇制剂等。随着对壳聚糖物化和生物性质的深入认识，研究人员发现壳聚糖具有独特的粘连性和跨细胞膜性。利用这一特性，Mumper等首次将壳聚糖用作转基因非病毒载体，通过改变其分子量可得到尺寸100-600nm的DNA/壳聚糖复合物微粒。MacLaughlin等将壳聚糖和其低聚物与质粒DNA形成复合物，考察了对COS-1细胞的转染情况。实验发现分子量小于10⁵的壳聚糖可与DNA形成粒径100-200nm的纳米微粒，且复合物在10％的血清中稳定性好，能得到满意的转染率。Roy等利用口服途径将DNA/壳聚糖复合物释放到小鼠肠道上皮细胞，转染基因成功表达Arah2蛋白，减缓对免疫系统过敏性反应。

为了改进壳聚糖载体的转基因特性，近来，研究人员研制了一些壳聚糖衍生物载体。Lee等以脱氧胆酸对壳聚糖进行改性，与质粒DNA复合后，尽管转染率比脂质转染胺低，但仍可获得对COS-1细胞较高的转染率。

为了提高壳聚糖载体的靶向性，Mao等将运铁蛋白和KNOB蛋白配体结合到壳聚糖上，配体修饰的壳聚糖载体分别使基因对HEK293和HeLa细胞的转染率提高4倍和6倍。

但是，目前所研究的壳聚糖/DNA复合物均通过自身的质子化氨基与DNA通过静电相互作用而形成。强烈的静电相互作用一方面有助于复合物的形成，但另一方面对复合物解离起到阻碍作用，进而降低了转染率。Kuhn等以理论计算研究了DNA与阳离子两亲性分子形成复合物时电荷的变化，结果表明，疏水性足够强的两亲性分子可在很低的浓度下使复合物呈电中性或发生电荷反转，即呈正电性。从转基因的安全角度而言，减小载体的用量可降低毒副作用，且借助亲疏水性的调节可调控载体与细胞的亲和性。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法。该方法采用转基因的载体烷基化壳聚糖亲疏水性可调，无细胞毒性，在较低的电荷比下能与质粒DNA复合，并能抗核酸酶对DNA的降解，以烷基化壳聚糖为载体复合DNA构成的微粒在血清中用ELISA方法测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值接近在相同的条件下以质子转染胺(lipofectamine)为载体转染的CAT光密度值1.26.