[发明专利]谷氨酰胺酶,谷氨酰胺酶基因,新的重组DNA及生产谷氨酰胺酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶基因，新的重组DNA，和生产谷氨酰胺酶的方法

背景技术

谷氨酰胺酶是一种酶，它能将L-谷氨酰胺水解成氨和L-谷氨酸，L-谷氨酸也是一种增甜剂(甜味剂)成分。谷氨酰胺酶在食品加工业起着重要的作用，例如，它可以应用于酱油或其它通过酶水解蛋白生产的调味品的制造业。已经从不同的物种中分离出谷氨酰胺酶，有关它的酶学特性和基因也已有报道(如日本专利公开(Kokoku)号6-38748)。

在使用日本酒曲麦芽的酱油制造业和调味品制造业中，为了通过遗传工程技术改进谷氨酰胺酶及提高酶的产量，从日本酒曲麦芽中获得酶是重要的。

采用这种方式能容易地改进水解蛋白产物(如酱油)的质量并可降低价格。

发明内容

因此本发明的目的是提供一种由日本酒曲麦芽中获得的谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶基因，新的重组DNA，和制备谷氨酰胺酶的方法。

经过多方面的研究和分析，本发明成功地分离出了源于酱油曲霉(Aspergillussojae)的一种谷氨酰胺酶，并确定了它的结构，完成了本发明。

即，第一项发明是根据如下(a)或(b)的一种谷氨酰胺酶：

(a)一种含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)一种含有相对于氨基酸序列(a)进行缺失、取代或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，该蛋白具有谷氨酰胺酶活性。第二项发明是编码根据如下(a)或(b)的蛋白的谷氨酰胺酶基因：

(a)一种含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)一种含有相对于氨基酸序列(a)进行缺失、取代或增加一个或多个氨基酸的蛋白，该蛋白具有谷氨酰胺酶活性。

第三项发明是含有根据如下列(a)或(b)DNA的谷氨酰胺酶基因：

(a)一种含有SEQ ID NO：1所示的碱基序列的DNA；

(b)一种在严格条件下能与含有(a)所示的碱基序列的DNA杂交的DNA，该DNA编码具有谷氨酰胺酶活性的蛋白。

第四项发明是一种新的重组DNA，其特征在于上述谷氨酰胺酶基因插入载体DNA。

第五项发明是一种含有上述重组DNA的转化体或转导体。

第六项发明是制备谷氨酰胺酶的方法，包括在培养基上培养上述转化体或转导体，从培养产物中收集谷氨酰胺酶。

具体实施方式

下面将对本发明进行详细描述。1.一种谷氨酰胺酶和编码它的基因

本发明的谷氨酰胺酶是根据如下列(a)或(b)的一种谷氨酰胺酶：

(a)一种含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)一种含有相对于氨基酸序列(a)进行缺失、取代或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有谷氨酰胺酶活性。

可通过将源于曲霉属的丝状真菌的染色体DNA或cDNA的天然存在的谷氨酰胺酶基因进行克隆，然后将克隆引入适宜的载体-宿主系统进行表达而获得蛋白(a)。

如(b)中所表明，该蛋白可以包含相对于氨基酸序列(a)进行缺失、取代或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，只要该氨基酸序列具有谷氨酰胺酶活性。在本发明中，“多个”通常意味着2至300，优选2-170，更优选2-50，最优选为2-10，这些取决于谷氨酰胺酶蛋白的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类。

这种突变的谷氨酰胺酶，即蛋白(b)的获得，可以通过在天然存在的谷氨酰胺酶基因的碱基序列中导入一种突变来产生出突变的谷氨酰胺酶基因，这种突变包括取代、缺失、插入、增加或倒置，然后将该突变基因导入一个适宜的载体-宿主系统进行表达。

将突变导入基因的方法包括，例如位点特异性诱变，PCR方法引入的随机突变，和其中基因被选择性剪切并在去掉或增加选择的核苷酸后被重新连接的方法。

依据本发明的谷氨酰胺酶基因是含有编码蛋白(a)或(b)DNA的基因。依据本发明的谷氨酰胺酶基因可以是一种在严格条件下能与编码蛋白(a)或(b)的DNA杂交的基因，并且该DNA编码的蛋白具有谷氨酰胺酶活性。在本发明中，“严格条件”指这样的条件，其中钠离子浓度在50-300mM，优选150mM，同时温度在42-68℃，优选65℃。

含有编码蛋白(a)的DNA的基因的例子是含有SEQ ID NO：1所示碱基序列的DNA。该DNA是一种天然存在的谷氨酰胺酶基因。