[发明专利]应用PCR－SSCP－STR技术筛测21三体综合征的方法

说明书

技术领域  分子生物学

背景技术  21三体综合征(又称先天愚型或Down综合征)是人类最常见的染色体病，在活产婴中其发病率约为1/600-1/800，我国21三体综合征的总现患率为0.47‰，城市为0.26‰，农村为0.56‰^[1]。患者主要症状为先天性智力发育低下，还常伴有先天性心脏病等疾患。目前尚无有效治疗方法，因此对Down综合征胎儿进行产前诊断具有重要意义，从70年代开始我国开展了对21三体综合征的产前诊断，主要是用细胞培养，染色体制备的方法，这种方法费时较长，技术要求较高，难于适用大规模的产前普查。90年代初国外学者报导了通过荧光标记技术，用PCR方法快速诊断Down综合征^[5-10]。人类基因组的STR位点遵循孟德尔的遗传规律，STR具有高度的多态性，80年代后期许多研究开始使用STR作为DNA的标志物，设计引物进行PCR扩增特定染色体序列，应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析方法，来检测DNA中的微小碱基变化。这种方法能快速、灵敏地检测基因突变和多态性。正常人DNA的STR位点有2对等位基因，而21三体综合征患者因为多了一条染色体，所以DNA的STR位点。有6对等位基因。通过引物对进行PCR扩增多态性的DNA序列后，单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，DNA构象差异将出现泳动变位，表现出电泳带位置的差异。发明目的  本发明应用短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)作为遗传标记，通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增，应用单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)分析技术，能够在分子水平上简便、快速和准确地诊断21三体综合征。

发明内容  本发明应用短串联重点序列作遗传标记，在21三体综合征的关键区位选择了2个STR位点，它们分别位于D21S1414和D21S1411位点，与Down综合征核心区紧密连锁^[11]。设计2对引物，通过聚合酶链反应，对这2对等位基因进行PCR扩增。具体步骤如下：1、PCR扩增  采用2针对D21S1411和D21S11的特异引物^[3]PCR扩增21号染色体2个短串联重复位点(short tandom repeat，STR)，反应体系总体积50μl，含基因组DNA 0.1μg，引物0.5μmol/L，dNTP 100μmol/L，TaqDNA聚合酶2.0U，缓冲液5μl，最后加灭菌蒸馏水使反应体积为50μl。所有样品统一混合反应液分装，用灭菌矿物油覆盖。反应条件为：95℃变性5分钟，接着运行30个循环(95℃变性45秒钟-60℃退火35秒钟-70℃延伸45秒钟)，最后72℃延伸5分钟。引物序列为5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’，5’-tat-gtg-agt-caa-ttc-ccc-aag-tga-3’，5’-gtt-gta-tta-gtc-aat-gtt-ctc-cag-3’。2、低离子强度(low ironic strength，LIS)SSCP分析：参照文献^[4]LIS-PCR-SSCP方法制备8％聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液。将扩增产物2ul加入20ul 1×LIS缓冲液混合，98℃变性5min，取10ul上样，25℃300V电压，预电泳15分钟，电泳分离5-9小时。电泳结束后，取下凝胶，放入1％冰乙酸中固定10分钟，然后放入0.2％硝酸银中染色20分钟，最后放入显色液(1.5氢氧化钠-0.4％甲醛)中显色。干胶。观察结果并照像，本发明对19例Down综合征患儿及其父母和3例Down综合征胎儿及其父母进行了检测分析。提取基因组DNA，进行PCR扩增，变性为单链DNA后，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳5-9小时。经银染色后干胶，观察结果并照像。本发明对19例Down综合征患儿及其父母和3例Down综合征胎儿及其父母进行了检测分析。提取基因组DNA，进行PCR扩增，变性为单链DNA后，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳6-15小时。经银染色后干胶，观察结果并照像。22例21三体综合征患者及其父母在D21S1414和D21S1414位点经一对引物(5’-aaa-tta-gtg-tct-ggc-acc-cag-ta-3’，5’-caa-ttc-ccc-aag-tga-att-gcc-ttc-3’)扩增后，片段长度约为239bp。21例患者PCR-SSCP构象与母源的构象完全相同，与父源的构象部分相同。一例与母源和父源的构象均相同，父母为纯合子。22例患者及其父母在D21S1414和D21S1411位点经一对引物(5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’)扩增后片段长度约为172bp。22例患者PCR-SSCP构象与母源的构象完全相同，与父源的构象部分相同。研究结果表明，21三体综合征患者因为较正常人多了一条染色体，用PCR扩增DNA上的STR位点，通过SSCP分析技术可明确患儿的染色体数目，并且明确确定多出来的染色体的父母来源。