[发明专利]一种异基因嵌合体，其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种异基因嵌合体及其制备方法，和在延长同种异体心肌和皮肤移植存活中的应用。

背景技术

器官移植是目前对于难以治愈的终末器官疾病可采用的有效方法之一。然而移植排斥反应仍然是影响器官移植成功的重要因素。通过诱导抗原特异性免疫耐受的方法解决移植排斥是较为理想的策略之一。五十多年前，Owen等观察到同卵双生牛体内存在来自对方的异基因嵌合体，可接受来自对方的皮片移植，随后的研究也证实在新生动物体内建立异基因嵌合体，可有效延长移植物存活。但是在成年受体体内诱导形成异基因嵌合体比较困难，经典的诱导异基因嵌合体的方法多采用放射线的照射，或者大剂量免疫抑制剂等首先破坏或/和抑制受体的免疫系统，这种诱导方法的毒副作用阻滞了其在实际临床工作中的开展，因此临床实践要求深入研究新的方法诱导建立异基因嵌合体，以延长移植物存活。

发明内容

在器官移植排斥反应中，活化的T细胞扮演着重要的角色。而T细胞的完全活化需要两个或多个信号，其中由抗原传递的是第一信号，由共刺激分子提供的共刺激信号被称为第二信号。如果仅有第一信号而缺乏第二信号，会导致T细胞非但不能激活，反而处于一种无能应答的状态。未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)仅表达MHC II类分子，但低表达或不表达共刺激分子，当其刺激T细胞时，可造成特异性的无能应答，在诱导免疫耐受中又具有不可忽视的地位。本发明利用了imDCs的这一特点，通过imDCs诱导一相对短暂的特异性免疫耐受状态，在这个特殊的免疫阶段引入异基因骨髓细胞，为其生存提供有效的时间窗口，建立异基因嵌合体，所述嵌合状态的形成可有效延长移植物的存活，为防治器官移植排斥反应提供了新的特异性方法。

本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：

建立未成熟树突状细胞诱导异基因嵌合体

供体骨髓细胞经rmGM-CSF和TNF-α刺激后制备未成熟树突状细胞(imDCs)，注射入受体小鼠数天后再输注供体骨髓细胞可在受体内诱导异基因嵌合体，所述的异基因嵌合体可延长移植物存活时间。

本发明对受体鼠(BALB/c，H-2d)经尾静脉注射灭活的供体小鼠C57BL/6(H-2^b)imDCs(3×10⁶/100μl/只)，3天后输注新鲜制备、未加分离的供体骨髓细胞(2×10⁷/100μl/只)，用腹腔注射免疫抑制剂阿霉素或尾静脉注射灭菌生理盐水/或无任何预处理的情况下同步接受等量的骨髓细胞输注的小鼠为对照。2周后经眼眶取血，以流式细胞仪检出同种异基因细胞的百分比代表异基因嵌合体存在的指标。结果显示：单独注射灭菌生理盐水组或仅输入骨髓细胞组，均未在外周血中检测到H-2^b表型的淋巴细胞；经阿霉素处理组输注骨髓细胞后一过性地检出H-2^b表型的淋巴细胞，异基因嵌合体水平平均为1.42±0.42％，事先注射imDCs组在骨髓细胞输注后14天开始直至一年后均可检出H-2^b表型的淋巴细胞的存在，120天时异基因嵌合体水平平均为5.84±1.33％，提示imDCs可诱导形成异基因嵌合状态。并发现注射imDCs后3天内输注骨髓细胞均可在长时间内检出水平较高的异基因嵌合；5天后输注者仅在短期内一过性地检出异基因细胞；而7天后输注骨髓细胞组则完全没有形成嵌合，证实imDCs所诱导形成的受体T细胞的不应答期只维持有限的时间，3×10⁶/100μl/只imDCs免疫受鼠，3天后接种骨髓细胞，均可不同程度诱导形成持久的异基因嵌合。表1是ImDCs诱导异基因嵌合体的检出率，表2是未成熟树突状细胞注射后不同时间输注骨髓细胞诱导形成异基因嵌合体结果，表3是注射不同剂量imDCs诱导异基因嵌合体形成结果，其中：A：注射2×10⁶/100μl/只imDCs组；B：注射一次3×10⁶/100μl/只imDCs组；C：注射两次3×10⁶/100μl/只imDCs组；D：注射三次3×10⁶/100μl/只imDCs组；B、C及D组之间异基因嵌合体水平在不同时间点有显著性差异，p＜0.05，C和D组内在21天后不同时间点之间异基因嵌合体水平有显著性差异，p＜0.05。

具体实施方式

实施例1

异基因嵌合体延长心肌移植物的存活