[发明专利]烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因、蛋白和制备方法及其应用

说明书

                      技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种烟草钙调素依赖型蛋激酶基因和其编码的蛋白及此基因和蛋白的制备方法。同时本发明还涉及这种钙调素依赖型蛋白激酶基因在烟草中的用途。

                      技术背景

在植物发育过程中，Ca²⁺通过同其靶蛋白相互作用起着非常重要的作用，两个研究的比较多的植物Ca²⁺靶蛋白是钙依赖型蛋白激酶(CDPKs)及钙调素(CaM)。目前已对多种CDPKs进行了生化和分子生物学分析，并已探讨出它在植物生理和发育过程中的多种功能。同样对CaM的研究亦显示它参与植物发育和环境应答反应，然而有关植物中CaM结合蛋白功能的研究却很少，特别是钙调素依赖型蛋白激酶，简称CaMKs的功能研究还是空白。Ca MKs由Ca²⁺和CaM进行双重调节，以其独特的结构而有别于CDPKs。在酵母和哺乳动物中的研究显示CaMKs是CaM介导的信号传导的关键组份，在这些有机体中CaMKs已得到鉴定并被证明参与介导许多细胞活动过程，包括基因的转录，细胞周期，神经记忆，碳水化合物代谢，细胞骨架功能等。但是在本发明申请之前，没有人公开或发表过植物钙调素依赖型蛋白激酶基因在植物中的用途。

                        发明内容

本发明的目的在于提供了一种烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因及其编码的蛋白质。该基因最先从烟草悬浮细胞中分离出来，后来证明玉米，水稻，拟南芥等植物中都有该基因的存在。其特征是：该基因主要具有编码蛋白激酶催化区的核苷酸序列和编码钙调素结合区的序列，且基因全序列为SEQ IDNO：1，该蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一个目的在于提供了制备这种新的钙调素依赖型蛋白激酶基因及其编码的蛋白质的方法。

实际上，烟草钙调素信号型蛋白激酶在烟草中的应用。 

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：制备基因具体步骤：1.提取烟草mRNA，用Straregenc公司ZAP-cDNA Synthesis kit按出厂商建议建立的烟草cDNA文库。2.利用MCK1(从玉米中分离到的钙调素依赖蛋白激酶基因)为探针筛选，文库用含MCK1p550筛选，阳性克隆测序得到基因的部分序列。3.再设计特异引物将基因的5’端和3’端测通，这样就得到了基因的全序列。制备蛋白具体步骤：1.Bac to Bac杆状病毒表达载体的构件，目的基因克隆到P^FASTHTb供体质粒。2.用碱法提取重组杆粒DNA，重组杆粒DNA转化Sf9细胞，收获重组病毒。3.融合病毒感染细胞72h后，室温收获细胞，纯化融合蛋白。

本发明还提供了一种载体，它包括钙调素依赖型蛋白激酶基因或其变异体，表达载体的一个重要特征是含有适当的启动子和翻译控制件。多种表达载体可以从商业途径获得，常用的载体包括但不限于质粒，噬菌体，病毒等，但最常见的首选质粒。

在本发明的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌，本发明优先的是农杆菌，更优选的是农杆菌LBA4404。本发明也提供了一种将所述载体导入植物细胞的方法，如基因枪注射法，细菌导入法。本发明优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404烟草叶盘导入法。

在本发明中，提供了一种含钙调素依赖蛋白激酶基因的载体转化的植株。在本发明中，上述植株选自烟草。

在本发明的另一个方面，提供了产生能表达钙调素依赖蛋白激酶基因转化烟草的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤1)钙调素依赖蛋白激酶基因连接到可表达调控序列上，形成可转化或表达的载体；2)将步骤1)中制备的载体转入植株；3)筛选阳性植株。更具体的，本发明提供了一种产生能表达钙调素依赖蛋白激酶基因转化烟草的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤1)克隆的钙调素依赖蛋白激酶基因连接到质粒PMD上，形成可转化或表达的载体；2)将步骤1)中制备的载体转入农杆菌，再导入植株；3)筛选阳性植株。