[发明专利]克隆来自烟草的细胞色素P450基因

说明书

本发明涉及烟草(Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文中称为P450和P450酶)的核酸序列以及使用这些核酸序列来改变植物表型的方法。

背景

细胞色素P450催化多范围的化学上不同底物的酶反应，包括内源和生物异源底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，P450参与的生化途径包括植物产物合成，如类苯丙醇(phenylpropanoid)、生物碱、类萜、脂类、生氰糖苷和硫配糖体(glycosinolate)(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198，49：311-343)。细胞色素P450也称为P450-硫醇血红素蛋白，通常作为多成分电子转移链中的末端氧化酶，此转移链称为含P450的单加氧酶系统。特异催化反应包括脱甲基、羟基化、环氧化、N-氧化、磺氧化、N-、S-和O-脱烷基、脱硫、脱氨基以及氮、硝基和N-氧化基团的还原。

烟草植物P450酶的不同作用包括影响多种植物代谢物如类苯丙醇、生物碱、类萜、脂类、氰糖苷、硫配糖体和其它化学实体的宿主。近几年中，显然一些P450酶可影响植物的植物代谢物组成。例如，长期以来需要改进某些植物的风味和香味，这是通过育种改变其所选脂肪酸的分布；然而对于参与控制这些叶组成水平的机制所知甚少。下调与脂肪酸修饰相关的P450酶可促进所需脂肪酸的积聚，所需脂肪酸提供更优选的叶表型品质。P450酶的功能和它们在植物组成中的广泛作用仍有待发现。例如，发现一类特殊P450酶催化脂肪酸分解成不稳定的C6-和C9-醛和-醇，它们是水果和植物“清新(fresh green)”气味的主要贡献者。可改变其它新靶向的P450水平以提高叶组成的性质，这是通过修饰烟草叶中的脂类组合物和相关分解代谢物。一些这类叶组成受衰老影响，衰老刺激叶品质性质的成熟。其它报导显示P450酶在改变脂肪酸中发挥功能性作用，这些脂肪酸参与植物-病原体相互作用和疾病抗性。

在其它例子中，暗示P450酶参与生物碱的生物合成。降烟碱是烟草(Nicotianatabacuum)中发现的次要生物碱。假定其生成是通过P450调节的烟碱脱甲基，接着在N位置酰化和亚硝基化，从而产生一系列N-酰基降烟碱(acylnonicotine)和N-亚硝基降烟碱。认为由推断的P450脱甲基酶催化的N-脱甲基是烟草中降烟碱生物合成的主要来源。认为酶是微粒体的，因此迄今为止没有成功纯化烟碱脱甲基酶，也没有分离参与的基因。

此外，假设但没有证明P450酶的活性受遗传控制并也受环境因素的强烈影响。例如，当植物到达成熟阶段时，认为烟草中烟碱的脱甲基显著增加。另外，认为脱甲基酶基因包含转座因子，转座因子存在时可抑制RNA翻译。

在本发明前，P450酶的多样性、它们不同的结构和功能使烟草P450酶的研究很困难。此外，克隆P450酶至少部分受到阻碍，因为这些膜定位的蛋白质一般存在丰度低且通常对于纯化不稳定。因此，需要鉴定植物中的P450酶和与这些P450酶相关的核酸序列。在烟草中仅特别报道了几种细胞色素烟草P450蛋白。本文所述发明包括发现了大量细胞色素P450片段，它们在其序列同一性基础上对应于几组P450种类。

概述

本发明涉及植物P450酶。本发明进一步涉及来自烟草的植物P450酶。本发明也涉及在植物中表达受乙烯和/或植物衰老诱导的P450酶。本发明更涉及植物中有酶活性的核酸序列，例如加氧酶、脱甲基酶等或其它，以及使用这些序列以使这些酶的表达减少或沉默。发明同样涉及植物中发现的P450酶，其所含降烟碱水平高于降烟碱水平较低的植物。

一方面，发明涉及核酸序列，它们示于SEQ.ID.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147。

在第二个相关方面中，这些核酸序列同一性超过75％的片段被分组，这取决于它们的区域同一性，区域对应于细胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一个核酸到终止密码子。代表核酸组和各种类示于表I。