[其他]L-苏氨酸的发酵生产方法

说明书

本发明采用乳糖发酵短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）的ＡＨＶ和ＡＥＣ双重抗性、并通过以琥珀酸为唯一碳源的平板分离培养基（简称为琥珀酸培养基ＳＡＭ）选择得到的变异株Ｃ２－１２６１（ＡＨＶ^r　ＡＥＣ^r　ＳＡＭ^g）作为Ｌ－苏氨酸生产菌，可在发酵培养液中积累１６ｍｇ／ｍｌＬ－苏氨酸，继而采用通常的离子交换提取工艺从中分离收集结晶状Ｌ－苏氨酸。

本发明涉及L-苏氨酸的发酵生产方法。

发酵法生产L-苏氨酸，已有报道采用乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium Lactofermentum）的α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）和S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）双重抗性变异株作为L-苏氨酸生产菌。本发明使用的L-苏氨酸生产菌，则是从乳糖发酵短杆菌出发诱导的、具有AHV和AEC双重抗性并通过以琥珀酸为唯一碳源的平板分离培养基选择（以下简称SAM⁹，意指growing on succinicacid medium）的变异株乳糖发酵短杆菌C2-1261（该菌株已以CGMCC NO.0084的保藏号于1985年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）。首先从野生型菌株乳糖发酵短杆菌ATCC13869出发诱导AHV抗性和AEC抗性，再赋予SAM⁹标记，即可获得本发明的变异株。

以下说明选育本发明变异株的具体方法。首先从ATCC13869出发，按照文献（中森茂，椎尾勇：＊酵と代谢，32：56，1975。）所述方法选育AHV抗性和AEC抗性变异株，从中筛选获得乳糖发酵短杆菌B7-8354（AHV^＊ AEC^＊）。将隔夜培养于斜面培养基的B7-8354的菌体用0.1MpH7.2磷酸盐缓冲液制成浓度为10⁸个/毫升的单细胞悬浮液，加入甲基磺酸乙酯（最终浓度为0.4M），31℃振荡处理1小时，中止反应后将处理液涂布于琥珀酸培养基（SAM）上，31℃培养2～6天，挑选在该培养基上生长较快的大菌落，即为SAM⁹变异株。为了测试各变异株的L-苏氨酸生产能力，将各变异株的斜面培养菌体接一环于盛有5ml发酵培养基的试管（2×20cm）或20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，31℃振荡培养72小时后测定发酵培养液中的L-苏氨酸含量。图1表示从B7-8354出发诱导获得的175株SAM⁹变异株的摇管产酸分布。图2表示最高株C2-1261（AHV^＊AEC^＊SAM⁹）与其亲株B7-8354（AHV^＊AEC^＊）产酸能力的比较。结果表明，由于诱导SAM⁹变异，使L-苏氨酸产量大幅度提高。

发酵培养液中L-苏氨酸的分离收集可采用通常的离子交换提取工艺进行。

实施例1

将培养一天的乳糖发酵短杆菌C2-1261的斜面菌体接一环于盛有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，31℃振荡培养72小时，培养液中L-苏氨酸含量可达16mg/ml。合并各摇瓶培养液共得1升，离心去除菌体和碳酸钙，上清液流入732阳离子交换树脂吸附，稀氨水洗脱，洗脱液经脱色浓缩、冷却结晶，得到L-苏氨酸粗结晶11克。再经重结晶擦作，可得纯度为98.5%以上的L-苏氨酸精结晶8克。

斜面培养基组成（%）

葡萄糖 0.5 NaCl 0.5

牛肉膏 1.0 蛋白胨 1.0

琼脂 2.0 pH 7.0

琥珀酸培养基组成（%） 发酵培养基组成（%）

琥珀酸钠 5.0 葡萄糖 10.0

（NH₄）₂SO₄ 0.15 （NH₄）₂SO₄ 3.0