[发明专利]用于纯化人生长激素的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过使用疏水作用层析以商业规模纯化人生长激素(hGH)的方法，其有效地分离在通过DNA重组技术的生长激素生产过程中形成的已剪铡的(clipped)激素部分。

背景技术

人生长激素(hGH)是垂体来源的蛋白，其具有多种重要生物功能，包括蛋白合成、细胞增殖和新陈代谢。hGH是约22kDa的191个氨基酸残基的多肽。已将重组人生长激素(hGH)作为细胞内和分泌蛋白在大肠杆菌中表达。已将一系列层析和/或非层析方法用于获得纯蛋白。已报道在人生长激素中在140-150氨基酸残基之间的区域对多种蛋白酶敏感。这导致蛋白的蛋白水解裂解(proteolytically cleaved)形式，其物理性质不同于完整分子的物理性质。hGH的这种变型可在纯化过程中生成，且其除去在治疗级生长激素蛋白生产中引起主要挑战。为了实现hGH用于治疗目的的应用，必须除去已剪铡的分子。

现有技术描述在许多方面不同于本发明的技术，例如处理参数、所用设备、分离靶部分的优先次序、使用相的数量、使用的溶剂、分离杂质的类型。几个现有技术的文献公开更适用于作为分析技术而不是工业分离方法的技术。

US 4332717公开疏水作用层析用于纯化人生长激素的应用。该专利提纯由人垂体腺提取的hGH而与重组hGH或其纯化无关。所以，在此方法中生成的杂质不同于在重组激素中存在的杂质。除了使用不同的介质和不同的柱以外，该方法使用不同的压力条件、不同的温度条件和不同的结合和洗脱缓冲液。洗脱梯度也不同。它还描述蓝色琼脂糖(blue sepharose)或琼脂糖在分离中的应用而没有教导用于洗脱的有机和水溶液的混和物的用途，其是本发明的本质特征之一。

以下参考文献涉及通过重组DNA技术获得的生长激素的纯化。在文献中，已知数篇专利如US4861868，其描述用于生产重组猪生长激素的方法；US4705848，US4694073，US4731440，US5064943，US4975529，US5023323，US5109117和US6410694涉及增溶和变性(naturation)方法作为重要特征，但这些在本发明的范围之外。

美国专利6022858涉及hGH的制剂，其中该hGH用Zn和任选地用赖氨酸或钙离子预处理，此后向其中加入苄醇且将pH调至2-9。

美国专利5734024教导用于测定重组hGH的生物活性的方法并且对于分析目的是良好的。

美国专利5182369教导在pH低于6.5下操作且两步沉淀是必要特征的方法。然而，使用酸性pH的处理条件可能导致蛋白的聚集或酸水解并且是不利的。

美国专利6451347描述了用于hGH的纯化方法，其中进行与金属离子例如Zn离子的配位，其不是本发明的特征。该专利描述由hGH降解生成的变体而不是剪铡部分。

美国专利6451987强调用于纯化包括hGH的肽的阳离子交换方法的应用，但没有提及该已剪铡的激素部分与完整hGH分子分离。

美国专利6437101教导使用了不用离液剂的含水两相萃取的技术。该方法繁琐，由此不易于实施。

在文献中通过专利号引用的专利被解释为已被作为参考包括由此涉及所述专利的文本。

即使现在此类纯化过程中的实际问题还是分离从巨大靶分子中产生的已剪铡的分子。由于分子内存在的某些其他链段这些剪铡部分保持束缚在一起。

有关用于分离hGH变体，包括已剪铡的变体的疏水作用层析的应用的非专利现有技术文献包括下列三个已发表的文件。

Pavlu和Gellerfors，Bioseparation(1993)，3：257-265公开了重组人生长激素Genotropin的疏水作用层析。

Gellerfors等人，Acta Pediatr Scand(Suppl)(1990)，370：93-100教导通过高效液体层析技术的分离和鉴定生长激素变体的方法。

Wu等人，J.Chromatogr.(1990)，500：595-606公开了高效疏水作用层析在鉴定DNA来源的人生长激素的特征中的应用。