[发明专利]无细胞蛋白质合成方法

说明书

本申请是申请日为2001年8月28日、申请号为01814793.3(国际申请号为PCT/JP01/07356)的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用了无细胞系统。

背景技术

基因组计划即将结束，其课题的中心迅速从遗传基因结构分析扩展到遗传基因功能分析。一般认为，细胞内的蛋白质本身不能单独发挥功能，其功能是通过多种多样的蛋白质基因、核酸、低分子种以及细胞膜成分等互相协调、相互作用发现的。另一方面，以其相互作用的总和在生物学领域发挥着功能。

作为后基因组计划的一个中心课题是分析多种多样蛋白质基因的聚合体结构与功能的关系。研究中所获得的成果，可以预见的在包括结构生物学和生物化学等基础生物学等的研究，及作为其应用的医学领域的遗传基因翻译产物同病因的关系的阐明，以至在医药研制的广阔领域中提供一种极其重要的理论。

作为在生物体外高效率地在细胞内进行蛋白质合成反应的方法，迄今为止，正在积极地研究，例如：从生物体中提取细胞内含有的作为蛋白质翻译装置的核糖体等的成分；并在该提取液中加入翻译模板、作为基质的氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液，而且通过再加入其它有效因子，在试管内合成蛋白质的所谓无细胞蛋白质合成法等。(特开平6-98790，特开平6-225783，特开平7-194，特开平9-291，特开平7-147992)。

在供无细胞蛋白质合成用的反应系，即无细胞蛋白质合成系中使用的蛋白质合成用的细胞提取液或生物体组织提取液的配制中，正在使用大肠杆菌、小麦胚芽或家兔网状红血球等。由于无细胞蛋白质合成系在肽合成速度和翻译反应的准确性两个方面保持了与细胞相媲美的性能，且具有不需要复杂的化学反应工序和繁杂的细胞培养工序的优点，迄今为止研制了实用性的系统。然而，一般从生物体细胞提取的细胞提取液，其蛋白质的合成性极其不稳定，因此蛋白质合成效率低，另外还因为保存中的细胞提取液的质量也显著下降，因此由无细胞蛋白质合成系获得的合成量只有放射性同位素标识可检测出的程度的很少的量，而不能用作实际生产蛋白质的手段。

作为解决现有无细胞蛋白质合成系缺点的方法，本发明人等此前提供了如下的无细胞蛋白质合成的方法(WO00/68412号公报)(WO01/27260号公报)：

(1)无细胞蛋白质合成用细胞提取物制剂以及无细胞蛋白质合成法；以及(2)具有通用性及高效率功能的模板分子以及利用其的无细胞蛋白质合成方法。

而且还报告了为提高蛋白质的合成效率、连续合成无细胞蛋白质的合成装置。作为现有的连续式无细胞蛋白质合成装置，可以举出如使用超滤膜法、透析膜法以及将翻译模板固定在树脂上的柱色谱法等[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123～142]。其中，由于超滤膜法和透析膜法操作简便，因此被广泛使用。然而，在采用这些膜的连续法中也存在着尚待解决的难题：①所使用的膜材料强度低；②由于网眼阻塞而导致膜功能下降；③由于操作繁杂，因而需要熟练的技术等。

而且，通过利用超滤膜法和透析膜法等，手动进行的连续式无细胞蛋白质合成方法虽在由少数遗传基因合成蛋白质中可利用，但高效率地从多数遗传基因生产蛋白质是很困难的。因此面对研制可高效率地从多数遗传基因生产蛋白质的高效率全自动多检测体蛋白质合成系统，解决现有连续式无细胞蛋白质合成方法缺点的新技术的开发乃是当务之急。

发明内容

本发明提供一种无细胞蛋白质的合成方法，该方法采用分批式连续扩散，其特点在于：使含有生物体提取物的合成反应溶液(反应相)与基质以及能量源供给溶液(供给相)直接接触，通过两相的直接接触界面自由扩散，连续向反应相的翻译反应系提供供给相的基质以及能量源分子，同时排出在反应相生成的副产物，进而延长合成反应的延续时间，提高合成反应效率；

而且本发明可获得一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：在上述无细胞蛋白质的合成方法中，使用小麦胚芽提取液作为生物体提取物；

另外本发明可获得一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：在上述无细胞蛋白质的合成方法中，使用大肠杆菌提取液作为生物体提取物；

而且本发明的范围也包括无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：在上述无细胞蛋白质的合成方法中，将反应相生成的副产物稀释、排出到供给相中；