[发明专利]与可调流式电穿孔室相关的方法和装置

说明书

                          发明背景

本申请要求2004年5月12日提交的美国临时专利申请序列号60/570,317的优先权，该申请已完整纳入本文作为参考。

I.发明领域

本发明涉及用瞬时电场处理细胞的领域，更具体涉及细胞的电穿孔。更具体地说，本发明涉及用于可调流式电穿孔(flow electroporation)的方法、电穿孔室及相关装置。

II.相关领域的描述

自从1970年代早期开始电穿孔就被用于将分子插入到动物或植物细胞内。研究者证实，细胞暴露于短暂持续的高压电场中可导致细胞膜上形成通道，分子，其中包括大分子如蛋白质和DNA，可通过该通道进入细胞内。这些通道被称为电孔洞(electropore)，是由高压电场造成的细胞膜局部破裂引起的通透性升高区。这些孔洞存在的时间虽然短暂，但是足以满足大分子如质粒DNA分子进入细胞的需要。细胞虽然能够耐受这些孔洞的形成，但是，如果形成的孔洞过多，其产生的过程以及由此导入的分子也可能会杀死细胞。由于这种电穿孔过程会导致电流(虽然短暂)通过传导性的细胞悬液，因此，根据焦耳定律电极会产生热量。这种热量可使细胞悬液的温度升高，如果热量过多，会使细胞的温度升高到足以导致细胞死亡的程度。初期进行电穿孔时用的是特殊的容器，其中有彼此相对的电极，二者之间可产生基本均匀的电场。最方便的是用两个平板电极，分别固定在矩形容器或矩形室相对的两个壁上。将准备进行电穿孔的细胞悬液与操作者希望将其导入到细胞内的分子混合，加入到容器或室内，然后将其置于两个电极之间，这样细胞悬液就会混入到与电极接触的液体中。为了影响分子通过电穿孔导入到细胞内的效果，在电极上通以一次或多次短时间的高压电场脉冲，从而对电极之间的细胞悬液施以高压电场脉冲。目前市场上最常见的电穿孔容器的容积都有限，每次处理的细胞悬液量很小(通常低于1ml)。如果每次加入到容器内进行电穿孔的细胞量很小，那么对大体积的细胞悬液进行电穿孔就是不切实际的。

一般来说，对大体积的细胞进行电穿孔必须保持无菌。重复在容器内加样以及混合集中电穿孔的细胞是不可能保持无菌的。虽然这种电穿孔法方便而简单，能够满足许多研究者进行小规模细胞电穿孔的要求，但是，还需要寻找其他的方法，特别是能够方便地对大体积的细胞进行电穿孔，同时又能保持无菌环境的方法。在封闭的无菌环境内对大体积的细胞进行电穿孔可使电穿孔用于人类的细胞治疗。因此，在整个操作过程中能形成并保持封闭的无菌流动通路的方法和装置是我们最需要的。

在20世纪80年代，有一些研究者开始研究用于处理大体积细胞的流式电穿孔法(美国专利4,752,586，5,612,207，6,074,605，6,090,617，本文都已完整纳入作为参考)。一般来说，用于电穿孔的流动装置包含两个平行电极，要进行电穿孔的细胞悬液持续而稳定地流过两个电极之间，直到整个细胞悬液都进行了电穿孔。在细胞悬液稳定地流过两个电极之间时，高压脉冲被施加到细胞上。在电极上重复施加高压脉冲会导致热量的产生，因此必须通过冷却装置将热量带走，防止电极和细胞悬液的温度过高。流式电穿孔装置包含带电极和接口的电穿孔室，细胞悬液可通过接口注入。电极与能给电极提供高压脉冲的电路相连。高压脉冲由程序控制计算机控制。现在已开发出了流式电穿孔系统，该系统能够对较大体积的细胞进行电穿孔，能够制备出已导入目的分子的活细胞。