[发明专利]固定剂组合物

说明书

发明背景 

本发明涉及一种用于保存组织和生物样品的固定剂组合物。组织保存产生于追溯到文艺复兴时期的早期解剖学研究中对尸体保存的需要。这在某种程度上利用了通过更为古老的尸体防腐法、皮革和食品加工/保存的实践而获得的知识。在十七和十八世纪，专家们特别重视并且制作了(家畜和人类起源的)畸形体标本集，用于在整个欧洲运输。这需要一种在操作时没有毒性的、透明的、容易获得的流体或溶液。最初，正如在食品保存中使用的那样，酒精被广泛地用于该目的，但是从十九世纪开始，甲醛(“福尔马林”)逐渐可加以利用，它是不能饮用的而且不用征税，因而它提供的优点超过其缺点：变色和组织变化。除此之外，它具有强的杀真菌/杀细菌特性，这即使在知道病原生物体的发育之前就察觉到了。 

甲醛依然是临床和研究组织和生物样品保存的支柱，因为组织学、细胞生物学和组织病理学这些基于显微镜检查的科学的整个知识库需要图象特征的连续性。 

随着免疫细胞化学和早期DNA研究的发展，人们首次探查了甲醛对组织的作用的精确化学基础。虽然很快就确定了在结构组织蛋白与脂蛋白和糖蛋白的蛋白部分之间形成交联的倾向，但是几乎没有探寻另外的知识。遗憾的是，没有研究过组织渗透的特征和动力学。也没有研究过这种中等强度的还原剂(是一种醛)通过环境氧的氧化作用的降解速率。 

交联作用导致充当表位的三维蛋白结构的掩蔽，这种交联作用被视为对不能采用很多抗原的原位标记来检测这些抗原的解释。这即使在新鲜组织提取物的悬浮液中和使用奥克特罗尼法(Ouchterlony technique)时，这些也是明显存在的。对于一些应用，通过使组织过热、破坏交联键(抗原挽回)而对这种缺陷进行了校正。其它方案涉及通过向基于甲醛的溶液的各种添加降低交联形成的程度。这些之中有很大毒性的、重金属(其中包括汞)盐。为了在组织处理之前造成不完全的交联，还尝试了各种降低强度的甲醛。少数方案利用纯酒 精作为冷冻的切片或很小的活检的固定剂。 

对于实现为常规诊断目的而获得的组织和生物样品的分析(以构成组织的细胞中存在的DNA为目标)而进行的分子生物技术而言，交联的形成现在被视为一个主要障碍。 

组织样品外层的蛋白组分的最初交联的一个附加作用是建立一种扩散屏障，这种扩散屏障阻碍固定剂进一步进入尺寸在几个毫米以上的生物组织样品(即，大多数临床上有关的活检，特别是外科切除术标本)的更深部分。 

甲醛的缓慢渗透使这类样品中存在的大量DNA/RNA在这类过程被固定剂的渗透阻止之前就被降解得无法利用。除了增强降解之外，交联最终形成时掩蔽DNA/RNA，使其不受为了原位杂交或聚合酶链反应而使用的探针和引物的作用。结构上结合在DNA和RNA的大分子中的蛋白质与样品中存在的其它蛋白质的交联作用损害了从组织和其它分析用生物样品中提取DNA。经常采用诱导附加断裂的试剂进行提取时，这些片段常常太短了，只能使基于聚合酶链反应的研究中非常短的片段得以扩增，这显著降低了可能从这类研究中获得的信息量。 

可能最为重要的是，这类技术在诊断程序中难于实现，正如随后的低的到非常低的程序灵敏度一样，不能自信地解释阴性结果。 

因此，现有的技术状况是，在进一步分析处理或为制备显微镜载玻片而进行的处理之前基于组织和生物样品的保存坚定地基于使用单独的甲醛或者使用甲醛作为各种混合物的主要成分。作为甲醛的替代物，已经使用过C_1-6的醛(很多是与甲醛组合使用以及除了甲醛之外还使用)；这些都导致相当的有害作用(见下文)。 

这不仅事实上阻碍了为常规诊断和研究目的快速实现改进的免疫细胞化学测试，而且更为重要的是，完全阻碍了在常规临床实践中有效地引入旨在DNA研究的分子生物技术。 

此外，前文没有提到过，在工作场所大规模使用甲醛溶液有各种严重的缺点。它是一种已知的致畸剂，与癌症的发生有关，可能促进工业变态反应的发生，而且在直接暴露时有相当毒性。这在实验室、运输容器和组织处理设备的设计和操作中需要广泛而昂贵的安全措施。 

从临床实践中彻底消除该试剂仍然有待实现。 

目前，非交联的保存剂的不可利用性导致使用分子生物技术的生物(例如疯牛病中的兽医CNS样品)样品的集中研究的高成本。这类样品是在没有固定的情况下被运输的，因而潜在地是有传染性的。这已经需要使用昂贵而麻烦的抗传染程序和措施。