[发明专利]培养人胚胎干细胞

说明书

                     相关申请的交叉参考

本申请要求2005年6月29日提交的美国临时专利申请序列号60/695,100以及2004年9月8日提交的美国临时专利申请序列号60/608,040的优先权。

                 关于联邦政府资助研究或开发的声明

本说明书中描述的一些工作受到美国政府拨款资助，而一些工作未获得资助。本说明书中所述的关于衍生新的人胚胎干细胞系的方法的工作未受到美国政府任何拨款资助。本发明在一定程度上是利用下述机构授予的美国政府资助下完成的：NIHRR017721。美国政府对本发明享有一定权利。

                             发明背景

干细胞被定义为能够分化成许多其它分化细胞类型的细胞。胚胎干细胞是来自胚胎的干细胞，能够分化成大多数，如果不是全部，成熟机体的分化细胞类型。干细胞被称为是多能的，这是指它能够分化成许多细胞类型。一类受到研究机构高度关注的多能干细胞是人胚胎干细胞，这里简称为人ES细胞，这是一种来自人胚胎来源的胚胎干细胞。人胚胎干细胞由于能够在培养基中无限增殖并由此而能够(至少原则上能够)提供细胞和组织以替代缺陷或受损的人组织而受到极大科学关注。人胚胎干细胞培养物的存在有可能提供无限量的人细胞和组织以用于各种有助于人体健康的治疗方案和研究计划。可以想像，在未来，将能够增殖人胚胎干细胞并使其定向分化成特定谱系以产生出于治疗目的可移植入人体的分化的细胞或组织。

已经描述了产生和培养人胚胎干细胞的基础技术。现有技术的确有效，但一些目前用来培养人胚胎干细胞的方法有限制和缺点。一种限制意义特别重大。大多数现有人胚胎干细胞系在一定程度上或在其它程度上已经直接暴露于小鼠细胞或暴露于其中已经培养过小鼠细胞的培养基。发现来自现有细胞系的一些人ES细胞展示出人类细胞通常不产生的唾液酸残基Neu5Gc，这一事实倍受关注。最初的产生和培养人胚胎干细胞的技术要使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞作为饲养层，在该饲养层上可培养人胚胎干细胞。成纤维细胞饲养层通过一些仍不十分清除的机制使得干细胞能够保持在未分化状态。随后发现，如果使干细胞接触“调理培养基(conditionedmedium)”也能获得相同的现象。调理培养基无非就是已经培养过饲养细胞(如MEF)的干细胞培养基。无论饲养细胞是能赋予培养基某些因子还是能从培养基中除去某些因子，其结果都是调理培养基可用来培养干细胞使其不发生分化。任何一种培养条件，即人ES细胞直接在鼠饲养细胞上生长或使用调理培养基都涉及这样的问题，即一种或多种试剂如病毒能从小鼠细胞传递到人ES细胞。如果培养人胚胎干细胞的一个目的是产生最终可植入人体的组织，就高度需要干细胞从未暴露于其它物种的细胞或者暴露于曾用来培养其它物种的细胞的培养基。因此，在长期培养人胚胎干细胞技术的持续发展中最感兴趣的是找到能增殖和培养人胚胎干细胞但不含成纤维细胞饲养层的培养条件。

一些培养基配方能够在一段时间内使人ES细胞维持未分化状态，但长期培养时将不能维持这种状态。具体地说，我们定义来自最初的种子培养物的人ES细胞培养板上生长至细胞铺满该相同的培养容器为一个“传代”。我们发现一些培养基配方允许培养人ES细胞一或两个传代不发生严重分化，但在随后的传代中细胞迅速分化。我们已经开始相信，为得到确实能够支持人ES细胞无限增殖而不分化且不含饲养细胞或调理培养基的培养基，培养基必需支持培养人ES细胞处于基本均匀且未分化状态至少5代。培养物在培养期间维持相对同质和未分化并保留人ES细胞所有重要特征也是重要的。

培养中的人胚胎干细胞的一个特有性状是，如果条件不够理想，这种细胞则有分化趋势。当在培养时过分要求维持人ES细胞处于未分化状态时则容易诱导人ES细胞分化。大多数培养条件将导致一定水平不希望的分化，尤其是在正在生长的ES细胞集落边缘周围。尽管培养ES细胞时可以有一定程度不希望的分化，但目的是定义能够尽可能使培养物维持未分化即得到尽可能少的分化细胞的培养条件。我们认为，我们已经采用特别严格的标准来定义将支持无限培养未分化的ES细胞培养物的条件。