[发明专利]产生肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的工程化肿瘤归巢细胞

说明书

技术领域

本发明涉及表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的肿瘤归巢细胞 (tumor-homing cells)及其在抗肿瘤治疗中的用途。

发明背景

调节异常的细胞凋亡机制在淋巴增生疾病的发病机理和发展中起着关键作用， 可导致癌细胞的存活时间比其正常寿命长并最终获得化学-辐射抗性[1]。所以，细 胞凋亡途径意味着有吸引力的治疗目标，可以恢复恶性细胞凋亡敏感性或者启动细 胞凋亡激动剂[2]。为了调节细胞凋亡基因和蛋白质，可设计多种策略，针对细胞 凋亡的内在途径(Bcl-2、Bcl-X_L)、外在途径(DR4、DR5、FLIP)或者会聚途径(cIAP2) [3]。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)属于死亡受体配体的TNF家族[4]。

WO97/01633公开了编码TRAIL的分离DNA序列、含有所述DNA序列的表 达载体以及重组TRAIL多肽。

TRAIL与在许多癌细胞的细胞表面上表达的死亡受体4(DR4)和死亡受体5 (DR5)结合[5]。将可溶性TRAIL与DR4或DR5相结合可激活半胱天冬蛋白酶 (caspase)并导致细胞凋亡[6]。

Liu Zhongyu等人(J Clin Invest.Vol112，no.9，9.11.2003，1332-1341)揭示了 通过重组腺病毒与TRAIL转换的树突状细胞以及治疗关节炎的潜在医学用途。但 没有提及所述细胞可能在治疗肿瘤方面的应用。

体外和体内研究均提示，由于对癌细胞具有高的特异性以及具有有效的抗肿瘤 活性，可溶性重组TRAIL可能在抗肿瘤治疗中扮演关键角色[7]。事实上，TRAIL 选择性诱导许多转化细胞的凋亡，而不影响正常细胞[4]。另外，将TRAIL给予小 鼠，对结肠癌[8，9]、乳腺瘤[10]、骨髓瘤[11]或者神经胶质瘤[12，13]的移植瘤有 明显功效。

在小鼠和非人灵长类动物身上进行的毒性研究表明，正常肝细胞和角化细胞对 TRAIL的三聚体产生抗性[14，15]，而它们对非优化TRAIL制剂或者配体的抗体 交联变体所诱导的细胞凋亡表现出很高的敏感度[16]。当使用高剂量TRAIL三聚 体时，肝毒是否是一个主要问题仍然存在争议。

使用可溶性TRAIL的另一个限制是，在大量的各种肿瘤细胞株中观察到凋亡 应答受损，需要延长培育时间或者需要采用很高剂量的可溶性TRAIL来控制细胞 凋亡[17，18]。对于任何体内治疗方案，当静脉注射TRAIL之后其药物动力学状 况(血浆半衰期32分钟，消除半衰期4.8小时)确定，延长暴露时间以及高浓度等情 况都是不可转移的[10]。为了克服可溶性重组TRAIL和特异性目标肿瘤细胞相关 的限制，现时利用不同动物模型探索了多种腺病毒介导的TRAIL基因转移方法[19， 20]。

不过，基因转移方法主要取决于肿瘤的有效感染以及避免要生效的免疫清除 [21]。另外，仍要解决涉及全身性注射腺病毒载体的一些安全问题[22]。例如，TRAIL 的腺病毒基因转移克服了肝细胞瘤细胞凋亡应答受损的问题，但也能导致初级人肝 细胞发生严重凋亡[19]。目前，基于腺病毒的基因疗法主要依赖于编码TRAIL的 腺病毒在肿瘤内传递[23]。尽管有局部抗肿瘤活性，但TRAIL的肿瘤内传递却缺 乏系统性抗肿瘤活性，所以没有临床价值。

已经知道，各种类型细胞偏向返回肿瘤[24]，并与产生抗癌细胞分子所需的构 造体一起被载入。由于它们的归巢特性，CD34+细胞[25]和天然杀伤(NK)细胞[26] 可用作抗癌分子的传送载体。

在静脉输注后，CD34+细胞表现出特异的归巢性质，包括能够永久地定居于骨 髓中以及瞬时定居于肝和脾内[27-30]。这些归巢性质与粘附受体(例如CXCR-4、 VLA-4、VLA-5、CD44等等)的表达密切相关，这些粘附受体与特异性配体(例如 SDF-1、VCAM-1等等)相互作用，后者在位于骨髓小环境和肿瘤小环境的基质细 胞上表达[31-34]。

NK细胞是淋巴细胞亚型，通过主要组织适合性复合非限制机制在针对肿瘤细 胞的细胞免疫防御中起主导作用[35]。在静脉输注后，NK细胞返回骨髓基质和淋 巴器官，并且在受到合适的细胞因子信号影响下渗出肿瘤部位。因此，许多机构已 经寻求使用NK细胞返回肿瘤的性质以达到治疗目的[36-38]。