[发明专利]通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性核酸

说明书

背景技术

本发明涉及为实现有效向哺乳动物细胞递送功能性核酸而正在进行 的努力。更具体的，本发明涉及使用细菌性小细胞载体向哺乳动物细胞 递送功能性核酸。本发明对于消除被靶向细胞中的耐药性(特别是在癌和 AIDS疗法的情形下)、促进其中的细胞凋亡和抗击其中的致瘤性方面具 有特别的效用。

最近的进展已经突出地显示了各种向细胞引入功能性核酸的技术。 例如，基于脂质体的转染方法可以递送外源产生的核酸。然而，这种外 源性的方法有只能短暂发挥目标抑制作用的缺点。此外，脂质体在体内 是不稳定的。作为一种递送外源产生的核酸的选择，载体可以递送编码 内源性生成的功能性核酸的质粒。然而，对当前可用于此目的的病毒性 载体的安全性具有严重的关注。可例举的问题包括与野生型病毒的重 组、插入和致癌潜能、病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带大片段DNA 的能力有限、减毒病毒毒性的逆转、重组体病毒制备和分布的困难、低 稳定性、和有害反应，比如由现有免疫性引起的炎性反应。避免了这些 问题的方法将在更安全和更有效递送功能性核酸方面提供明显的益处。

递送功能性核酸的有效方法对逆转耐药性应该会特别有益。哺乳动 物细胞利用各种生物学过程以抵抗药物，这对于成功的癌治疗是主要的 障碍。相似的，耐药性限制了HIV治疗的效用，对于高效抗逆转录病毒 治疗(HAART)尤其如此，该治疗是基于联合应用核苷逆转录酶抑制 剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。

对化疗的临床肿瘤抗性可以是固有的或获得性的。固有抗性存在于 未能对一线化疗产生反应的肿瘤诊断时期。获得性抗性发生在对初始治 疗可能产生良好反应，但是在复发时表现出抗性表型的肿瘤中。这样的 肿瘤既对先前使用的药物又对新药物产生抗性，这包括有不同结构和作 用机制的药物。术语MDR(多药耐药性)描述了这种现象，其中肿瘤 细胞在暴露于单一药物后，对几种结构不相关的药物产生交叉抗性。

多药耐药性的机制是复杂的并且是多因素的，这主要是由于癌细胞 中高水平的基因组不稳定性和突变。典型的机制有药物失活、通过细胞 膜泵排出药物、降低药物流入、药物靶标的突变和启动细胞凋亡的失败 (Bredel，2001；Chen et al.，2001；White and McCubrey，2001；Sun et al.， 2001)。

药物排出是特别普遍的，并且可通过将药物从细胞内环境泵到细胞 外环境的膜相关蛋白质的过表达产生。这样的泵通常是ATP结合盒 (ABC)转运蛋白超家族的成员(Doige et al.，1993)。P-糖蛋白(PgP) 是一个这样的实例，并且是多种癌细胞中对MDR起主要作用的因素 (Endicott et al.，1989；Litman et al.，2001)。其它的实例包括MDR相 关蛋白质(MRP；Cole et al.，1992)、乳腺癌耐药性蛋白质(BCRP； Litman et al.，2000)、和肺耐药性相关蛋白质(LRP；a major vault protein；Scheffer et al.，2000)。在癌细胞(Gottesman et al.，2002)和病 原微生物(Van Bambeke et al.，2000)中已经鉴定了其它的多药物转运 蛋白。

由细胞毒性剂和放射引起的肿瘤细胞对细胞凋亡(程序性细胞死亡) 的抗性(SeHers and Fisher，1999)是另一种普遍的机制。这种机制通常 涉及抗细胞凋亡蛋白质比如B-细胞白血病蛋白质2(Bcl-2)、Bcl-X_L、 Bcl-W、A1/Bfl 1、Mcl-1的过表达，和p53蛋白质的突变。尽管对于象 Bcl-2的蛋白质是如何发挥它们的抗细胞凋亡作用的准确了解仍然是不 清楚的，但是在许多癌中所述蛋白质都被过表达，这些癌包括结肠直肠 癌、前列腺癌和乳腺癌(Hanada，et al.，1995；Bakhshi et al.，1985；Wang et al.，1996)。转录因子核因子κB(NF-κB)表达的增加也是肿瘤细胞获 得化疗抗性的主要机制(Wang et al.，1999)。