[发明专利]用于质粒DNA发酵的工艺

说明书

关于联邦资助研究或开发的声明

不适用

本申请要求2004年8月19日提交的临时专利申请序号#US60/603000的权益。

技术领域

本发明涉及共价闭合环状(ccc)重组DNA分子如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂交体的生产，特别是一种在发酵培养中高水平地生产所述DNA分子的方法。

发明背景

本发明涉及共价闭合环状(ccc)组合DNA分子的生产。这种分子在生物技术、转基因生物体、基因治疗、治疗性接种、农业和DNA疫苗中是有用的。

考虑到本发明，对现有技术进行了检索。大肠杆菌质粒早已经成为研究人员和业界使用的、唯一最重要的重组DNA分子来源。如今，随着下一代生物技术产品(基因药物和DNA疫苗)进入临床试验并最终进入医药市场，质粒DNA正变得愈发重要。质粒DNA疫苗可能寻求应用为用于病毒性、细菌性或寄生虫性疾病的预防疫苗；用于制备高免疫球蛋白产品的免疫剂；用于感染性疾病的治疗疫苗；或者作为癌症疫苗。质粒也可用于基因治疗或基因替换应用，其中，在对患者给药后从该质粒表达想要的基因产品。

现今，除了基本形式之外尚未规定FDA标准(参见：FDA关于用于预防感染性疾病适应症的质粒DNA疫苗的意见，1996)。但是，在某一天，质粒DNA纯度的国际标准可能相同于或非常相似于用于类似从大肠杆菌发酵生产的重组蛋白产品的那些，而且这样的标准超出了从已建立方法可获得的当前纯度。更引人注目地，可接受的标准——每剂量＜100pg宿主基因组的DNA(参见：FDA关于用于生产生物的细胞系表征的意见，1993)低于当前可得到的纯化质粒制品的水平(每1mg剂量100pg相当于每一千万分之一)。

用于获得质粒(通过细菌发酵)及其纯化(例如，通过碱裂解法(Birnboim，HC，Doly J.1979，Nucleic Acids Res.7：1513-1523))的基本方法是众所周知的。初始地，将已发酵的细菌细胞膏再悬浮和裂解(应用氢氧化钠和十二烷基硫酸钠的组合)，然后通过加入酸的盐(例如，醋酸钾)来中和该溶液，使细菌DNA和多数细胞碎片沉淀。大量的超螺旋质粒DNA保留在溶液中，并带有污染的细菌RNA、DNA和蛋白质，以及大肠杆菌内毒素(脂多糖，或LPS)。然后通过过滤分离到可溶的部份并进行各种纯化步骤，其可包括：核糖核酸酶消化；色谱法(离子交换凝胶过滤，羟基磷灰石，凝胶过滤，疏水作用，反相，HPLC，等)；渗滤；有机提取，选择性沉淀，等等。

明显地，提高原料的纯度和获得较好下游纯化是产业规模化制造临床级别DNA的基本目标。

发酵培养基的考虑

平衡培养基的设计是基于细胞能量要求和元素组成。一般地，以基本培养基或半合成培养基来满足营养的要求。

半合成培养基含有复合成分如酵母提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨。复合成份的添加供给了生长因子、氨基酸、嘌呤和嘧啶且经常支持更高的细胞密度。

碳占一半的细胞组成。因此，碳属于最高的数量。碳源提供能量和生物量，而且常常被用作限制性营养物。葡萄糖是常规的碳源。它被非常有效地代谢，并因此给予更高的细胞产率。但是，由于代谢溢流(称为克雷布特里效应)，高浓度的葡萄糖导致不想要的醋酸盐产物。也可使用甘油，而且在分批培养基中它经常是优选的碳源。尽管从甘油获得的细胞产量略为少于从葡萄糖获得的，但是甘油不会引起那么高水平的醋酸盐产物，而且可以较高浓度使用而无抑制性。甘油还支持降低最大特异性生长速率。

用无机或有机氮源可以满足氮的要求。氨水和铵盐(例如，NH₄Cl，(NH₄)₂SO₄)可用于基本培养基。半合成培养基从复合成份，包括酵母提取物、酪蛋白氨基酸和蛋白胨，部分或者全部地提供氮。

矿物质是生长、代谢和酶反应所必需的。一般镁、磷、钾和硫作为独特的培养基成份而被添加。磷酸二钾和单钾盐提供了钾和磷，而且还具有一定比例的缓冲剂功能。硫酸镁七水合物常被用作镁和硫的来源。其它基本矿物质包括钙、铜、钴、铁、锰、钼和锌。这些都需要较小的数量，而且常通过添加痕量矿物质溶液来提供，尽管它们通常作为主成分中杂质而存在。用氯化钠调节摩尔渗透压(osmolarity)。