[发明专利]用于在蚕中制备重组蛋白质的多聚核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及用于在蚕中制备重组蛋白质的多聚核苷酸。更具体地 讲，本发明涉及在可以用于由蚕进行有用重组蛋白质的大量生产的多 聚核苷酸、含有该多聚核苷酸的载体、以及使用该载体制备的转基因 蚕，还涉及从该转基因蚕所作的茧中提取有用重组蛋白质的重组蛋白 质的制备方法。

背景技术

蚕在变成蛹之前作茧。该茧的主要成分是绢蛋白质，每个茧含有 0.3～0.5g的绢蛋白质。绢蛋白质中约70％是丝心蛋白(fibroin)， 余量的约30％是由被称为丝胶蛋白(sericin)的蛋白质所构成的。 这些绢蛋白质是在绢丝腺合成的。绢丝腺是由后部绢丝腺、中部绢丝 腺以及前部绢丝腺构成的，分别在后部绢丝腺中特异性地合成·分泌 丝心蛋白，在中部绢丝腺中特异性地合成·分泌丝胶蛋白。从后部绢 丝腺分泌的丝心蛋白，通过绢丝腺的蠕动运动缓慢地送到中部绢丝腺， 并且通过分泌的丝胶蛋白包被四周，再送到前部绢丝腺，作为绢丝而 被吐丝。所以在所吐出的绢丝中，丝心蛋白在丝的中心，丝胶蛋白包 裹着丝心蛋白的周围而存在。

丝胶蛋白是起到浆糊的作用的蛋白质，发挥着使所吐出的绢丝相 互进行粘接的功能。相对于丝心蛋白对水具有极大的不溶性，而丝胶 蛋白比较易于溶于水中。由茧进行纺丝的情况下，通过将茧煮沸等操 作，去除可溶性的丝胶蛋白，只将不溶性的丝心蛋白纤维作为生丝进 行纯化。

本申请的发明人等着眼于蚕具有绢蛋白质的合成能力，开发了与 绢蛋白质一起使大量的重组蛋白质分泌到茧中的转化蚕。对于导入了 外来基因的转化蚕的制备，建立了将重组了来自鳞翅目昆虫 Trichoplusiani的DNA型转座子piggyBac的质粒载体微量注射到蚕 卵中的方法(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)。使用该基因导 入法将在绢蛋白质基因启动子的下游连接的人·胶原cDNA重组到蚕中， 开发以重组人·胶原作为茧或者绢丝腺内的蛋白质的一部分而产生的 转化蚕(非专利文献1)、或者申请专利(专利文献1-3)。还有， 也申请了涉及通过相同的方法，制备在绢丝腺或者茧丝中生产细胞因 子的基因重组蚕，从绢丝腺或者茧丝回收细胞因子的重组型细胞因子 的制备方法的专利申请(专利文献4)。

此外，本申请的发明人等，为了提高茧中的重组蛋白质的含量， 着眼于具有高转录活性的丝心蛋白的重链基因，确定作为从上游区域 开始具有促进基因的转录活性的最小区域的多聚核苷酸，提出了促进 外源基因表达的多聚核苷酸(非专利文献2-3)，或者申请专利(特 愿2003-147497)。

现有技术文献列表

专利文献1：特开2001-161214号公报

专利文献2：特开2002-315580号公报

专利文献3：特开2004-016144号公报

专利文献4：特开2003-325188号公报

非专利文献1：Tomita，M，et al，Nature Biotechnology.21， 52-56，2003

非专利文献2：第25回日本分子生物学会program/Lecture Abstracts，2002年11月25日，2P-1588

非专利文献3：第26回日本分子生物学会program/Lecture Abstracts，2003年11月25日，2PC-174

发明内容

如上所述，约70％的构成茧的绢蛋白质是在后部绢丝腺合成的丝 心蛋白。所以，利用丝心蛋白重链或者轻链的启动子以及增强子在后 部绢丝腺表达重组蛋白质基因的话，能够向茧中分泌大量的蛋白质。 这种情况下，因为重组蛋白质埋在不溶性的丝心蛋白纤维之中，所以 是用于得到例如大量的重组蛋白质和茧的混合物的有效手段。还有， 从该混合物中提取重组蛋白质，能够仅分离重组蛋白质。