[发明专利]尿苷5＇－二磷酸－N－乙酰半乳糖胺的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及作为低聚糖合成的重要底物尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)的制备方法。 

背景技术

用酶合成低聚糖的方法包括利用低聚糖水解酶的逆反应的方法和利用转糖基酶的方法这两种。使用转糖基酶的合成法，从合成收率和用于合成具有复杂结构的低聚糖等方面考虑，比利用水解酶的逆反应的方法更好，此外，近年随着重组DNA技术的进步，各种转糖基酶的大规模生产也随该技术的发展而发展。 

但是，在转糖基酶的合成法中所用的糖供体糖核苷酸除了一部分之外，其它的价格仍较高，目前的供应量仅在试剂水平。例如，作为UDP-GalNAc的制备方法，报道了使用半乳糖胺作为起始材料，将酶法和化学乙酰化组合合成UDP-GalNAc的方法。 

但是，由于存在如下问题：(A)只是实验室的小规模反应、(B)酶的制备难、(C)半乳糖胺磷酸化时必需补充ATP再生体系，整个反应工序的收率也低、(D)在反应液中残留UDP-半乳糖胺的情况下，目的物UDP-GalNAc与它的分离存在问题，因此未必是实用的方法(Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)、J.Org.Chem.，57，152-157.(1992))。 

此外，已报道了用尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺4-表异构酶(UDP-GlcNAc4-表异构酶)由尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成UDP-Ga lNAc的方法(WO2002/050267)，由于存在如下问题：(i)UDP-GlcNAc4-表异构酶在动物组织或菌体中的存在量极少、(ii)尽管可以通过重组DNA法制备UDP-GlcNAc4-表异构酶，但是该酶反应是平衡反应因此转化率低，并且作为底物的UDP-GlcNAc未完全消耗，大量留在反应液中，因此UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的分离非常困难，因此该方法也不是实用的方法。 

【专利文献1】 

WO2002/050267 

【非专利文献1】 

Methods Enzymol.，28，271-277，(1972) 

【非专利文献2】 

J.Org.Chem.，57，152-157.(1992) 

【非专利文献3】

J.Biol.Chem.271，23653-23656，(1996) 

【非专利文献4】 

J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959) 

【非专利文献5】 

J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998) 

【非专利文献6】 

J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996) 

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种使用价廉的底物，有效地酶促制备UDP-GalNAc的实用的方法。 

本发明者们对UDP-GalNAc的生物合成路径进行了详细探讨，发现结果如下，从而完成了本发明。 

首先，已报道病原性金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源于人、猪肝脏的各种尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)，除了具有催化下述(A)固有的转化反应的活性之外，还具有催化下述(B)的转化反应的活性(J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)、J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)、J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996))，尽管除了Staphylococcus aureus之外，还没有无病原性的来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的这样的报告，然而试验结果证实除了具有下述(A)的活性之外还具有下述(B)的活性。而且，例如如果使用来源于大肠杆菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由N-乙酰半乳糖胺1-磷酸(GalNAc1-P)和尿苷5′-三磷酸(UTP)合成UDP-GalNAc的话，可以解决UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖胺等按照现有方法与其它糖核苷酸分离的问题。 

(A)UDP-GlcNAc+焦磷酸lUTP+GlcNAcl-P 

(B)UDP-GalNAc+焦磷酸lUTP+GalNAcl-P