[发明专利]多个多核苷酸拷贝的稳定基因组整合

说明书

发明领域

已经发现大量天然存在的生物体可以产生有用的多肽产物，例如酶，其大规模生产是研究和商业化目的所需的。一旦鉴定了这类产物，那么就进行尝试以便研发产生高产量产物的生产方法。基于重组DNA技术广泛使用的方法在于克隆编码产物的基因，将该基因插入允许产物表达的合适的表达系统，并且培养包含该表达系统的合适的宿主细胞，所述的表达系统在有利于所述产物表达的条件下在染色体中得以整合或整合为染色体外实体。 

不考虑生产方法本身，一般理想的是能够增加所得多肽或蛋白质的生产水平。因此，进行尝试以便例如通过在强表达信号控制下插入编码所述产物的基因或通过在所述生产生物体中增加基因的拷贝数来增加产量。这后一种手段可以通过下列方式进行：将基因插入多拷贝质粒，不过，该质粒通常趋向于在所述宿主细胞中不稳定；或通过将基因的多种拷贝整合入生产生物体的染色体，一般认为该手段更具有吸引力，因为构建体的稳定性趋向于较高，使得可以将基因稳定地维持在生产生物体中。 

背景技术

EP 0 284 126和EP 166 628中披露了用于将基因的一或多拷贝稳定整合入原核细胞染色体的方法，在所述的原核细胞的染色体中已经携带了至少一种所述基因的空白。按照EP 0 284 126，用包含所述基因的另一拷贝的DNA构建体转化包含所述基因的宿主细胞，由此在合适的选择操作步骤后，获得了细胞，在其染色体中包含被对宿主细胞而言至关重要的内源性染色体序列分隔开的基因的两拷贝，且由此确保对整合的基因的稳定维持。可以重复该操作步骤以便产生在其染色体中携带基因的多拷贝的细胞。WO2002/000907中描述了将多核苷酸以位点特异性方式整合入在条件上对细胞而言必需的失活的染色体基因座，其中这些基因座可通过整合方法恢复。 

已经证实用链霉菌属(Streptomyces)噬菌体ΦC31的衍生物感染带有天 然结合位点attB以及异位导入的attB位点的宿主细胞导致将噬菌体整合入二者attB位点(Smith等2004.Switching the polarity of a bacteriophageintegration system.Mol Microbiol 51(6)：1719-1728)。 

实际上，可以使用Mx9噬菌体转化系统将基因的多拷贝导入包含由Mx9整合酶识别的多个结合位点的细胞(WO 2004/018635 A2)。 

发明概述 

当将基因导入细胞的DNA构建体上时，甚至在低-拷贝数构建体的情况下，通常可能难以在宿主细胞中实现编码目的多肽的基因的适当染色体整合，同时进行从该构建体上的启动子的活性地转录。这对为抑制性的或对宿主细胞而言甚至更具毒性的高于某些浓度的多肽类而言特别确切。避免这一问题的一种方式在于在使基因位于所述构建体上的同时使其沉默，以便仅在基因被适当整合入染色体时启动转录。 

通常关注将编码目的多肽的几拷贝的基因整合入宿主细胞染色体，有时达10或10个以上拷贝。用于同时整合所需数量的拷贝的方法与如上所述的分步方法相比可以节省时间。 

本发明提供了对这些问题的组合解决方法；它能够将编码目的多肽(类)的基因(或操纵子)的多拷贝进行同时染色体的位点特异性整合，同时还提供在通过异源启动子适当整合每个拷贝后启动所述基因转录的方式，所述的异源启动子可操作地与仅在成功整合后的基因连接。 

因此，本发明在第一个方面中涉及构建细胞的方法，在该细胞的染色体中包含编码至少一种目的多肽的可读框(ORF)或操纵子的一或多拷贝，每拷贝在异源启动子的转录控制下，该方法包含下列步骤： 

(a)提供在其染色体中包含位点特异性重组酶的第一识别序列(RS1)的一或多拷贝的细胞，其中RS1的每拷贝位于所述的异源启动子拷贝的下游； 

(b)将包含位点特异性重组酶的ORF或操纵子和第二识别序列(RS2)的多核苷酸构建体导入所述的细胞，其中RS2相对于ORF或操纵子定位(located)和定向(oriented)，使得RS2与细胞染色体中RS1拷贝的体内重组可以将所述的构建体整合入该染色体并且将ORF或操纵子置于异源启动子的下游并且与异源启动子相同取向；和 

(c)RS2与一或多拷贝的RS1在有位点特异性重组酶存在下重组，由此 将目的ORF或操纵子的一或多拷贝整合入染色体并且置于下列条件下：(i)直接在异源启动子转录控制下；或(ii)在启动子的下游和与启动子相同取向，但通过区域而分隔开，该区可以在一种或多种任选重组事件(events)后切除，由此将目的ORF或操纵子置于异源启动子的转录控制下。