[发明专利]从生物和细胞材料分离核酸的方法

说明书

相关申请的交叉参考

[0001]本申请是申请人的下述共同未决申请的部分继续申请：2004年12月22日提交的临时申请序列第60/638,621号和2004年9月16提交的申请序列第10/942,491号，而所述申请序列第10/942,491号是申请人的下述共同未决申请的部分继续申请：2003年11月17日提交的美国申请序列第10/714,763号和2003年11月17日提交的美国申请序列第10/715,284号。

发明领域

[0002]本发明涉及用于捕获和分离核酸的简化方法，特别地从生物来源，尤其是从血液和细菌培养物的材料捕获和分离总基因组核酸。本发明还涉及用于这些方法的、含有固相结合材料的试剂盒。

背景技术

[0003]分子诊断学和分子生物学中的现代技术(包括反转录、克隆、限制性分析、扩增和序列分析)，要求提取核酸。在其中发现有目标核酸的复杂的样品基质使得获取核酸的工艺被复杂化。此类样品包括例如来自组织的细胞、来自体液的细胞、血液、培养中的细菌细胞、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或从目标核酸扩增得到的溶液。样品基质经常含有显著量的污染物，在感兴趣的核酸被用于分子生物学或分子诊断技术之前所述污染物必须从所述核酸去除。

[0004]从上述细胞和组织产生的混合物中获得目标核酸的常规技术，需要使用有害化学品例如酚、氯仿以及溴化乙锭。酚/氯仿提取被用于此类步骤，以从目标核酸和多种污染物的混合物中抽提掉污染物。可选地，根据本领域中熟知的方法，使用氯化铯-溴化乙锭梯度。参见例如Molecular Cloning，由Sambrook等编著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，该在后方法之后，通过将乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸来沉淀保留在抽提的水相中的核酸物质。通常，通过离心从溶液中移出沉淀物，并且在水或缓冲溶液中重悬以作进一步使用之前，允许干燥所得到的沉淀物小球。

[0005]已经开发出更简单和更快的方法，其采用各种类型的固相，以从细胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分离核酸。此类固相包括各种形状和形式例如纤维的层析树脂、聚合物和二氧化硅基或玻璃基物质，过滤器以及包被的容器。当为小颗粒的形式时，有时提供磁芯，以帮助实现分离。

[0006]从全血DNA提取DNA是指从血中的白细胞提取。通常，处理血液，以选择性溶解红细胞，并且在沉淀或离心步骤之后，单独裂解完整的白细胞以暴露核酸内容物。消化蛋白质，并且得到的DNA用固相分离，随后用于序列多态性的测定、序列分析、RFLP分析、突变检测或其它类型的诊断试验。EP0796327B1中公开的方法涉及在特定固相支持物存在下，将含有细胞的样品如细菌培养物或全血与裂解去污剂混合。相反地，本方法省略了任何去污剂或裂解液的使用。另一方法涉及用抗体-包被的颗粒从全血选择性地捕获白细胞，接下来的步骤是裂解捕获的白细胞和将释放的核酸捕获在固体支持物上(美国专利申请公布2003/0180754A1)。

[0007]从细菌提取核酸，美国专利5,990,301公开了通过裂解从细菌或病毒分离核酸的方法，然后在阴离子交换剂上分离游离的核酸，用受控离子强度的溶液洗脱，然后用去污剂或层析载体处理，以去除内毒素。已经开发出含有固体结合支持材料的试剂盒，并可以在商业上获得，用于从细菌培养物和从人全血分离基因组的方法中。制造商提供的步骤总是详细说明，在开始核酸的移除和纯化之前必须裂解细胞。在使用固体支持物之前，有时也利用额外的沉淀步骤(例如K.Smith等，J.Clin.Microbiol.，41(6)，2440-3(2003)；P.Levison等，J.Chromatography A，827，337-44(1998))。

[0008]固相材料，在分离核酸中使用的一种类型的固相包括设计用于高效液相色谱(HPLC)的多孔硅胶颗粒。用阴离子交换剂对多孔硅胶颗粒的表面进行官能化，以在某一盐和pH条件下与质粒DNA交换。参见，例如美国专利4,699,717和5,057,426。在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的质粒DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其被用于下游过程之前必须被进一步处理，以除去盐。