[发明专利]生产具有多重胁迫耐受性的植物的重组表达载体以及使用其制备多重胁迫－耐受性植物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产具有多重胁迫耐受性的植物的重组表达载体，转化了 上述载体的多重胁迫耐受性植物，和制备所述植物的方法，所述重组表达 载体通过将多重胁迫耐受性基因附着到源于甘薯的氧化胁迫诱导性启动 子上以在叶绿体中表达所述基因而制备。

背景技术

包括植物的大多数生物不仅易受生物胁迫诸如病原体、昆虫、病毒等 的影响，而且易受各种环境压力诸如高温、盐、干旱、污染、损伤、冻伤、 过度光照条件、臭氧、二氧化硫、过度暴露于UV、渗透性冲击等的影响。 当植物受到如上述各种环境压力的影响时，其中生命支持必需的氧转变成 活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O^2-)、过氧化氢(H₂O₂)、氢氧自由 基等，这在体内引起严重的生理紊乱。精确地，少量的氧自由基在体内 足以在细胞中传导信号，并且在植物中诱导自我防御必需的基因(抗氧 化酶、热激蛋白等)的表达。然而，活性氧自由基的增加通过剂量-依赖 性方式引起生理紊乱，甚至引起细胞死亡。

最近，许多研究者对植物中氧自由基介导的信号传导途径非常感兴 趣。这是由于所述途径的调控使得细胞中抗氧化酶和宿主-防御蛋白的表 达增加，并且导致具有针对任何环境胁迫的强抗性的植物的发展(Kovtun， 等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)：2940-2945，2000)。依据最近的报道， MAP激酶级联(MARK级联)在植物中由氧自由基介导的信号传导途径 中起重要作用(Kovtun，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)：2940-2945， 2000)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种将超氧阴离子自由基(O^2-)转化成过氧 化氢(H₂O₂)的酶，并且按照酶中所包含的金属辅因子分为CuZnSOD， MnSOD和FeSOD。这些酶在细胞中分布不同，例如CuZnSOD在细胞质 和叶绿体中发现，MnSOD在线粒体中发现，以及FeSOD存在于叶绿体 中。SOD是一种消除生物体中由环境胁迫产生的氧自由基的重要的环境 耐受性因子，其可以用于产生医药供给、食品、化妆品等。并且因此，制 备包含SOD基因的表现出强活性胁迫耐受性的转基因植物导致具有针对 环境胁迫诸如臭氧、低温、除草剂等的强抗性的植物的发展(Plant Physiology，10：1049-1054，1995；US Patent No：5,538,878)。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种通过使用维生素C作为电子供体而 将H₂O₂转化成水的酶，并且在植物和昆虫中大量地发现。已知这种酶在 植物中存在于细胞质、叶绿体基质和类囊体膜中(Free Rad.Biol.Med.23： 473-479，1997)。

在植物的叶绿体中，氧含量相对高，并且应用从利用光能分解水产生 的电能操纵电子转运系统，因此这一器官对各种氧化胁迫非常敏感。因此， 叶绿体抗氧化能力的增加可能极大地帮助维持植物在环境胁迫下的生产 力。

到现在，为了开发胁迫耐受性植物，不管什么条件都能组成型表达的 CaMV 35S启动子，已经广泛地与具有针对具体胁迫的抗性的基因组合应 用，来构建表达载体。因此，得到的植物具有只针对具体的胁迫的抗性。 为了克服这一问题，需要制备一种表达载体，其包括能够在任何胁迫环境 下表达的启动子和胁迫耐受性基因，并且制备用所述载体转染的转基因植 物。

为了开发具有针对环境灾难的耐受性的转基因农作物，本发明人制备 了用于植物转化的新型表达载体，其通过将多重胁迫耐受性基因SOD(超 氧化物歧化酶)和APX(抗坏血酸过氧化物酶)附着到源于甘薯的氧化胁迫 诱导性过氧化物酶启动子SWPA2上而在植物的叶绿体中表达所述基因。 然后，本发明人通过组织培养再生从马铃薯、甘薯和高羊茅制备的转化植 物。最后，本发明人通过证实本发明的转基因植物具有增加的多重胁迫耐 受性而完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种用于植物转化的重组表达载体，其通过 将多重胁迫耐受性基因附着到源于甘薯的氧化胁迫诱导性启动子上以在 叶绿体中表达所述基因而制备。