[发明专利]酶－底物反应的监测

说明书

本发明涉及监测酶-底物反应的方法，鉴别酶活性调节剂或新的酶底物的筛选测定法，和在此类方法和测定法中使用的底物和电化学反应室(electrochemical reaction chamber)。

由氧化还原酶催化的反应可以电化学监测。参见，例如Barker PD，Hill HA.Prog Clin Biol Res.1988；274：419-33：Directelectrochemical probes of redox protein and redox enzymestructure and function。Allen等人(J.Electroanal.Chem.178(1984)69-86)，和Christensen and Hamnett(Techniques andMechanisms in Electrochemistry(1994)356-373)综述了细胞色素c的电化学。用于测定细胞色素P450活性的电化学系统在WO 00/22158及其中引用的参考文献中得到描述。然而，由非氧化还原酶催化的反应不能容易地进行电化学监测，因为没有明显合适的随着反应进程改变氧化还原状态的化学基团。

根据本发明应当理解，如果底物已被氧化还原活性基团标记，那么非氧化还原酶反应可以电化学监测。还应当理解，标记的底物的使用不局限于非氧化还原酶反应。本发明还可应用于氧化还原酶，并且因此提供监测氧化还原酶反应的新方法。

根据本发明，提供了监测酶对底物的修饰的方法，该方法包括：提供已用氧化还原活性基团标记的底物，和修饰该底物的酶；在适合于酶修饰底物的条件下孵育底物和酶；和通过氧化还原活性基团电化学监测酶对底物的修饰。

氧化还原活性基团使得能够使用标准电化学技术对酶进行动力学研究。例如，使用方法例如本领域技术人员众所周知的线性扫描伏安法(LSV)或循环伏安法(CV)可以产生伏安波形图。产生的伏安波形图可以用于例如测定酶的催化活性、酶反应速率、底物或抑制剂与酶结合的动力学，或进行竞争性抑制研究、测量热力学反应、筛选酶活性调节剂、或测量药物交叉反应性。

术语“氧化还原活性基团”在此处用于指可以对底物进行标记，并且能够在其中酶是催化活性的条件下改变其氧化状态(即，获得或失去电子或质子)的任何基团。当施加电位并根据时间的线性函数变化时，当针对施加的电极电压绘制电流时，对底物标记的氧化还原活性基团的氧化状态中的改变将产生伏安波形图。

根据本发明还提供了在本发明方法中使用的已由氧化还原活性基团标记的底物。

底物可以通过将氧化还原活性基团偶联至底物优选共价地而用氧化还原活性基团进行标记。氧化还原活性基团可以直接，或经由连接体偶联至底物。当使用连接体时，应当选择连接体的大小和化学性质，以使连接体对酶修饰底物的任何干扰最小化。

应当选择氧化还原活性基团，以在其中监测反应进程的条件下给出良好的电化学信号。氧化还原活性基团还应适合将其与底物偶联所需的化学操作。

氧化还原活性基团是本领域技术人员众所周知的。合适的基团的例子包括二茂铁、富勒烯和醌。

底物可以包括或由对应酶的全长天然底物，或仅对应天然底物的一部分的底物组成，条件是使用的底物在适当条件下仍可由酶进行修饰。例如，当酶天然底物是蛋白质或肽时，根据本发明使用的底物可以对应全长的蛋白质或肽，或对应蛋白质或肽的片段。底物可以包括或由重组肽或蛋白质组成。

底物可以由超过一个的氧化还原活性基团标记。氧化还原活性基团可以与底物的任何合适部分偶联，只要氧化还原活性基团不干扰酶对底物的修饰。当底物是肽或蛋白质时，氧化还原活性基团一般将共价偶联至肽或蛋白质的氨基和/或羧基末端氨基酸残基。

在本发明的优选方面，酶是非氧化还原酶。根据本发明的特别优选的方面，酶是激酶或磷酸酶。当酶是激酶时，底物包括在适当条件下通过激酶进行磷酸化的氨基酸残基。当酶是磷酸酶时，底物包括在适当条件下通过磷酸酶进行脱磷酸的磷酸化氨基酸残基。

在图1(a)中图解显示了激酶催化的反应。正方形表示底物肽链的氨基酸残基。激酶给特定的氨基酸残基添加了磷酸(由圆圈表示)，所述氨基酸残基一般在由激酶特异识别的10-20个氨基酸残基的基序中。磷酸酶催化逆反应。