[发明专利]由菠萝蛋白酶获得的清创组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述清创组合物含有：分子 量约23kDa的蛋白水解酶，以及菠萝蛋白酶抑制剂；其中所述蛋白水解酶 包括茎菠萝蛋白酶、ananain和半胱氨酸蛋白酶前体，并且其中所述菠萝蛋 白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的10％w/w。

2.根据权利要求1所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂 少于所述清创组合物的蛋白质含量的5％w/w。

3.根据权利要求2所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂 少于所述清创组合物的蛋白质含量的2％w/w。

4.根据权利要求3所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂 少于所述清创组合物的蛋白质含量的1％w/w。

5.根据权利要求1所述的清创组合物，其基本由从HPLC尺寸排除 柱TSK-Gel 3000_SWXL洗脱的单一蛋白质峰组成，所述单一蛋白质峰构成具 有分子量为约23kDa的蛋白质。

6.根据权利要求1至5任一项所述的清创组合物，其还含有一种药 学上可接受的载体。

7.一种由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，所述清创组合物含有 分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述清创组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制 剂，所述方法包括以下步骤：

(a)使用含有抗氧化剂的一种酸性溶液悬浮菠萝蛋白酶，所述酸性溶 液pH范围为从约2.4至约4；

(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.4至约4；

(c)添加助滤剂至步骤(b)的悬浮液；

(d)过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；

(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐以得到范围在从约40％到约 50％的硫酸铵饱和度；

(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约4；

(g)在3℃-10℃温育步骤(f)的悬浮液；

(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；

(i)将所述硫酸铵沉淀溶解于选择性含有抗氧化剂pH范围为从约2.4 至约4的酸性溶液；

(i)过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶； 并且

(k)冻干步骤(j)的保留溶液。

8.根据权利要求7所述的由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，其 包括以下步骤：

(a)使用含有1％抗坏血酸和正辛醇pH为约2.4至约2.6的0.3M醋酸 悬浮菠萝蛋白酶；

(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约3.5；

(c)添加包括二氧化硅的助滤剂至步骤(b)的悬浮液；

(d)通过压滤器过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；

(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐(285g/L)以得到约40％的硫酸 铵饱和度；

(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH为从约2.5至约3.5；

(g)在4℃温育步骤(f)的悬浮液约12-24小时；

(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；

(i)将所述硫酸铵沉淀溶解于含1％坏血酸pH为从约2.4至约2.6的 0.3M醋酸；

(j)通过10kDa超滤器过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10 kDa的蛋白水解酶；

(k)过滤步骤(j)的保留溶液以得到无菌溶液；并且

(l)冻干步骤(k)的过滤溶液。