[发明专利]含有与L－肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产L－肉碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及包括来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的L-肉碱生物合成相关基因的属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，和使用其生产L-肉碱的方法。

背景技术

L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物体中普遍存在，是负责将活化的长链脂肪酸经由线粒体膜转运到线粒体基质中的两性离子化合物。已知L-肉碱由赖氨酸或蛋白质中的赖氨酸(以下，称为“蛋白质赖氨酸”)生物合成。哺乳动物蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体。然而，在粗糙脉孢菌中，将游离赖氨酸用作L-肉碱的前体。在L-肉碱的生物合成中，形成作为中间体的ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛，和γ-丁酰甜菜碱。通过γ-丁酰甜菜碱羟化酶将γ-丁酰甜菜碱羟基化为L-肉碱。图1图解了在粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径。

L-肉碱可以通过化学合成、酶促半合成或微生物学方法生产。然而，肉碱的化学合成不可避免地导致DL-肉碱外消旋混合物，由此要求分离DL-外消旋混合物。关于L-肉碱的酶促半合成，例如，美国专利号4,221,869公开了使用肉碱脱氢酶(EC 1.1.1.108)和辅酶NAD，由二氢肉碱生产L-肉碱的方法。然而，二氢肉碱极其不稳定并由此可以自发分解为丙酮基三甲铵和二氧化碳。德国专利号DE-OS-3123975公开了由γ-丁酰甜菜碱生产L-肉碱的方法，该方法使用从粗糙脉孢菌分离的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(EC1.14.11.1)。然而，存在一个缺点，即在羟基化期间必须将α-酮戊二酸和还原剂(即，抗坏血酸)加入反应混合物。

关于通过微生物学方法生产L-肉碱，美国专利号5,028,538公开了生产L-肉碱的方法，该方法包括将大肠杆菌044K 74温育在含有巴豆酸甜菜碱(4-N，N，N-三乙基氨基巴豆酸)的培养基中并从培养物中回收L-肉碱。美国专利号4,708,936公开了通过将木糖氧化产碱菌(Achromobacterxylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)温育在含有巴豆酸甜菜碱和/或γ-丁酰甜菜碱的培养基中来生产L-肉碱的方法。然而，按照该方法，需要使用巴豆酸甜菜碱，其对于L-肉碱生物合成既不是前体也不是中间体，L-肉碱的产率不高。因此，微生物学方法需要提高L-肉碱的产率。

因此，在使用廉价前体搜寻能够高产率生产L-肉碱的生产L-肉碱的微生物同时，本发明人发现来源于粗糙脉孢菌的L-肉碱生物合成相关基因在属于肠杆菌科的微生物中良好表达，并由此完成了本发明。

附图简述

图1图解了在粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径；

图2是显示构建pT7-7carB的示意图；

图3是显示构建pT7-7carC的示意图；

图4是显示构建pT7-7carD的示意图；

图5是显示构建pT7-7carE的示意图；

图6是分别插入pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE的基因的电泳图(泳道1：标记物，泳道2：carB，泳道3：carC，泳道4：carD，和泳道5：carE)；

图7是粗提物的SDS-PAGE图，所述粗提物来自分别用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株(M：标记物，泳道1：阴性对照，泳道2：TMLH(52KDa)，泳道3：SHMT(53KDa)，泳道4：TMABADH(55KDa)，和泳道5：BBH(49KDa))；

图8是显示构建pT7-7BE的示意图；和

图9是显示构建pACYC184CD的示意图。

发明详述

发明的技术目的

本发明提供高产率生产L-肉碱的微生物。

本发明还提供了使用该微生物生产L-肉碱的方法。

发明内容

按照本发明的一方面，提供了属于肠杆菌科的微生物，其包括：编码来源于粗糙脉孢菌的N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(SHMT)活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和编码来源于粗糙脉孢菌的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸。