[发明专利]封闭系统多阶段核酸扩增反应

权利要求书

1.控制嵌套扩增反应的方法，所述方法包括如下步骤：

a)在流体封闭系统的反应室中，进行第一阶段扩增反应，包括使 用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶 多核苷酸，形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针 对每一种靶多核苷酸的初始引物；其中存在有荧光指示剂情况下扩增所 述靶多核苷酸，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中 的扩增子的数量相关的光信号；

b)监测所述反应室中的所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂 的光信号；

c)当所述光信号达到或超过阈水平时，自动分离有效部分的所述 第一阶段扩增反应的反应混合物；

d)在所述反应室中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中 扩增所述有效部分中的一种或多种第一扩增子以形成一种或多种第二 扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子每 一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子 的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中；以及

e)检测所述一种或多种第二扩增子以确定所述样品中是否存在 所述一种或多种靶多核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的反应 混合物处于所述流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述自 动分离步骤包括以流体形式将所述有效部分的所述第一阶段反应混合 物转移至第二反应室。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的所述 反应混合物处于所述流体封闭反应系统的反应室中，并且其中所述自 动分离步骤包括，除了保留在所述反应室中的有效部分外，以流体形 式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述反应室具有底部和位于所 述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过 所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混 合物被保留在所述反应室中所述出口之下。

5.如权利要求4所述的方法，其中保留在所述反应室中的所述体 积包括所述有效部分。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少 1分子所述一种或多种第一扩增子的一定体积的所述反应混合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少 100分子所述一种或多种第一扩增子的一定体积的所述反应混合物。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积 并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比 选自0.5％至10％的范围。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平是基线信号水平的 倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平对应由所述光信 号确定的增长曲线的最大、最小或零值。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光指示剂选自特异结 合双链DNA的插入染料或者包含特异结合扩增产物的寡核苷酸部分。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子 通过在所述第一阶段扩增反应中扩增参照序列而产生。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子 通过在所述第一阶段扩增反应中扩增靶多核苷酸而产生。