[发明专利]鼠李糖启动子表达系统

说明书

本发明涉及用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的载体。更具体而言，本发明涉及可在宿主中表达的新载体，它含有操作性连接于转录单元的L-鼠李糖操纵子的rhaBAD启动子区域，该转录单元含有：a)对于所述宿主来说是异源的核酸序列，b)操作性连接于所述核酸序列的原核生物信号序列，该原核生物信号序列选自糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白的信号肽。本发明还涉及使用这些载体异源表达编码例如多肽的核酸。 

发明背景 

已描述了许多用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的系统。但是，原核生物宿主系统中的大多数异源基因表达系统全部依赖于有限的细菌启动子组。最常用的原核生物启动子包括乳糖[lac](Yanisch-Perron等，1985，Gene33，103-109)、和色氨酸[trp](Goeddel等，1980，Nature(伦敦)287，411-416)启动子，和衍生自这两种启动子的杂交启动子[tac和trc](Brosius，1984，Gene27：161-172；Amann和Brosius，1985，Gene40，183-190)。其它可诱导的启动子系统，如可由阿拉伯糖诱导的araB启动子(WO8604356)、由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaSB(WO03068956)或由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaBAD(WO2004/050877)也已被描述用于蛋白质的异源表达。WO2004/050877描述了使用rhaBAD启动子在大肠杆菌中异源表达腈水解酶。在用L-鼠李糖诱导后，可在静止细胞测试中获得腈水解酶活性。但是，尤其是在复杂多肽(如抗体或抗体片段)的表达中，有利的是使用信号肽将多肽从胞质转移到非胞质位置(分泌)，因为胞质中异源蛋白质的过量生产通常伴随着错误折叠和隔离成不溶的聚集体(内涵体)。但是，由于信号序列可影响分泌的多肽的成熟区域中二级结构和三级结构的形成，适当的信号肽以及有用的启动子的选择对于功能性多肽的高产量而言是重要的。因此，仍需要提供替代的原核生物表达系统来异源表达核酸序列。

发明内容

通过提供新的载体将可实现依前述说明而显而易见的这些和其它目标，该载体可用于高水平表达所需的异源产物，它包含L-鼠李糖操纵子的rhaBAD启动子区域、异源核酸序列和选自糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白的信号肽的原核生物信号序列。在第一方面，本发明的目的是提供一种可在宿主中表达的新载体，该载体含有操作性连接于转录单元的L-鼠李糖操纵子的rhaBAD启动子区域，该转录单元含有：a)对于所述宿主来说是异源的核酸序列，b)操作性连接于所述核酸序列的原核生物信号序列，该原核生物信号序列选自糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白的信号肽，该核酸序列的表达由该启动子控制。还提供的是：所述新载体在原始生物宿主中核酸序列的受调节异源表达中的用途；可在宿主中表达的分离纯化的核酸序列，其含有L-鼠李糖操纵子的rhaBAD启动子区域、异源核酸序列和选自糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白的信号肽的原核生物信号序列；用所述载体或所述分离纯化的核酸序列转化的原核生物宿主；使用所述载体在宿主中生产多肽的方法；和含有如下区域的载体：启动子区域、异源核酸序列和由序列AGGAGATATACAT构成的翻译起始区域。 

本领域技术人员根据以下的详细描述将更易于了解其它目的和优点，下文的描述将结合以下的阐述性附图以及附带的权利要求进行。 

附图简述 

图1显示了质粒pBW22-Fab-H，其含有L-鼠李糖可诱导的启动子(PrhaBAD)、编码操作性连接于Fab片段的轻链(ompA-VL3-CL)和重链(phoA-VH-CH)的信号序列的序列和转录终止区域(rrnB)。 

图2显示了质粒pBLL15，其含有蜜二糖可诱导的启动子(PmelAB2)、编码操作性连接Fab片段的轻链(ompA-VL3-CL)和重链(phoA-VH-CH)的信号序列的序列、和转录终止区域(rrnB)。 

图3显示使用了不同表达质粒的未诱导的(—)和诱导的(+)W3110株的溶菌酶提取物的斑点印迹结果(用抗人轻链检测Fab，与碱性过氧化物酶偶联)。显 示了时间间隔。 

图4显示了质粒pAKL14，其含有L-鼠李糖可诱导的启动子(PrhaBAD)和具有改变的信号序列的Fab-H基因。