[发明专利]用于鉴定RHO激酶(ROK)调节物的高通量酶联免疫吸附测定(HT－ELISA)

说明书

技术领域

本发明涉及通过生物素化的肽测量ROK(Rho激酶)蛋白活性 的检测方法。

发明内容

本发明涉及用于鉴定调节(刺激、减弱、维持)ROK蛋白活性 的化合物的检测方法，其中

a]提供能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗体，此抗体能够识别来自a]的被磷酸化的肽；

d]提供化合物；

e]在能够使该肽发生磷酸化的条件下，孵育来自a]的肽与来 自b]的ROK蛋白以及来自d]的化合物；

f]按照e]的孵育完成之后，使用来自c]的抗体检测该肽的磷 酸化；

g]可以将来自f]的结果与另一实验结果进行比较，所述另一 实验中对来自a]的肽与来自b]的ROK蛋白而不含d]所给的化合 物进行孵育。

可以以酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(Radio Immun Assay，RIA)的形式容易地实现这样的检测。

至于如前所述测定步骤a]的肽可以由15至25个氨基酸之间 的大小组成。此肽可以包含如下氨基酸序列或由其组成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以以化学修饰的形式(如生物素化 或连接于DNA或抗体)使用测定步骤a]的该肽。

如前所述测定步骤b]的ROK蛋白可以包含人蛋白质的氨基 酸序列，或者可以从人生物材料衍生或取得。可以通过不同技术 (例如通过对生物材料的操作或包括重组特性的加工步骤)来制备 这样的ROK蛋白。可以例如将如前面公开的本发明的检测方法用 于高通量筛选调节ROK蛋白活性的化合物。

本发明还涉及成套药盒，其包括

a]能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]ROK蛋白；

c]能够识别来自a]的被磷酸化的肽的抗体；

d]可能的第二抗体，其能够识别来自c]的抗体，和/或连接 于标记系统(如碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、过氧化物酶、其它酶)；

e]可能的试剂、缓冲液和/或用于实现来自a]的肽磷酸化的 设备和/或ELISA装置。

以上提到的成套药盒的步骤a]的肽由15至25个氨基酸之间 的大小组成。该肽可以包含以下氨基酸序列或由组成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。根据测定步骤a]的肽可以以化学修 饰的形式(如生物素化、或连接于DNA或抗体)使用。如前所述测 定步骤b]的ROK蛋白可以包含人蛋白质的氨基酸序列，或者可 以从人生物材料衍生或取得。可以通过不同技术(例如通过生物材 料的操作或包括重组特性的加工步骤)来制备这样的ROK蛋白。

本发明还涉及如前面提到的成套药盒的制备方法，其中

a]提供能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗体，此抗体能够识别来自a]的被磷酸化的肽；

d]提供可能的第二抗体，其能够识别来自c]的抗体和/或连 接于标记系统(如碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、过氧化物酶、其它 酶)；

e]可能的试剂、缓冲液和/或用于实现来自a]的肽磷酸化的 设备，和/或ELISA装置。

f]来自a]至e]的组分被相应地包装并与说明书组合，所述说 明书涉及成套药盒的其它组分以及ROK蛋白检测的操作步骤。

如前所述的成套药盒可以例如用于确定ROK蛋白的活性，或 用于鉴定调节ROK蛋白活性的化合物，或用于高通量筛选。

此发明还涉及肽，所述肽包含如下氨基酸序列或由其组成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以对这样的肽进行化学修饰，例 如生物素化。本发明还涉及这样的肽用于测量ROK蛋白活性的用 途。

本发明的化合物应该意指通过化学合成产生或从天然来源分 离的任何有机化合物和/或碳水化合物。这样的化合物的分子量可 以在50至50000道尔顿之间。