[发明专利]用于转染真核细胞的固定的可降解阳离子聚合物

说明书

相关申请

本申请要求于2004年12月17日提交的美国临时申请第60/637,344号的优先权，在此以引用的方式将其并入。

发明背景

发明领域

本发明的实施方案涉及用于细胞转染的装置和方法。特别地，本发明的实施方案涉及细胞转染制剂和用该转染制剂处理的细胞培养装置。经处理的细胞培养装置可在室温下贮存并且提供简单快捷的转染方法。

相关技术的描述

基因转染方法可用于将核酸导入细胞中，还可用于研究基因调节和基因功能。高通量分析尤其有用，它可用于筛选多组DNA以鉴定编码具有所关注性质的产物的DNA。基因转染是将生物学上具有功能的核酸以核酸在细胞中保持其功能的方式递送和导入细胞中，尤其是真核细胞中。基因转染广泛应用于涉及基因调节、基因功能、分子治疗、信号转导、药物筛选、以及基因治疗研究的研究。随着对高等生物基因的克隆和分类的进行，研究人员设法揭示基因的功能并鉴定具有所需要性质的基因产物。不断增长的基因序列收集需要开发系统的和高通量的方法来表征基因产物和分析基因功能，细胞和分子生物学中其它领域的研究也是如此。

病毒基因载体和非病毒基因载体均已被用于基因送递。病毒载体表现出具有比非病毒载体高的转染效率，但是病毒载体的安全性妨碍了其可用性(Verma LM和Somia N.Nature 389(1997)，pp.239-242；MarhsallE.Science 286(2000)，pp.2244-2245)。尽管非病毒转染系统未表现出病毒载体的效率，然而由于非病毒载体与病毒载体相比其理论安全性较高，所以它们还是受到相当的关注。另外，病毒载体的制备是复杂且昂贵的过程，这限制了病毒载体的体外应用。与病毒载体的制备相比，非病毒载体的制备更为简单并且成本效益更高，这使得合成基因载体成为理想的转染试剂，特别是用于体外研究。

大部分非病毒载体模仿病毒进入细胞的重要特征以越过细胞屏障，该细胞屏障旨在防止外源遗传物质的渗入。根据基因载体的主链，非病毒基因载体可分为a)脂质/DNA复合物(lipoplexes)、b)聚合物/DNA复合物(polyplexes)、以及c)脂质/聚合物/DNA复合物(lipopolyplexes)。脂质/DNA复合物是核酸和脂质组分的的装配物，通常是阳离子型的。通过脂质/DNA复合物进行的基因转移称为脂转染。聚合物/DNA复合物是核酸和阳离子聚合物的复合物。脂质/聚合物/DNA复合物包含脂质和聚合物组分。通常这样的DNA复合物被进一步修饰以包含细胞靶向部分或细胞内靶向部分和/或膜失稳组分，例如病毒蛋白或肽或者破坏膜的合成肽。近来，也有将细菌和噬菌体作为穿梭载体用于将核酸转移到细胞中的描述。

大部分非病毒转染试剂是合成的阳离子型分子，并有报道其通过阳离子上的阳离子位点与核酸上的阴离子位点相互作用“包被”该核酸。带正电荷的DNA-阳离子型分子复合物与带负电荷的细胞膜相互作用辅助DNA通过非特异性胞吞作用穿过细胞膜。(Schofield，Brit.Microencapsulated.Bull，51(1)：56-71(1995))。在大部分常规基因转染方案中，细胞在转染前16至24小时被接种到细胞培养装置上。通常在单独的试管中制备转染试剂(例如阳离子聚合物载体)和DNA，并且将每种溶液分别在培养基(不含胎牛血清或抗生素)中稀释。然后在连续涡旋振荡(vortexing)混合物的条件下通过缓慢地将一种溶液加入到另一种溶液中小心地混合溶液。然后将混合物在室温下孵育15-45分钟，使转染试剂和DNA之间形成复合物并且除去残余的血清和抗生素。转染前，移除细胞培养基，并使用缓冲液洗涤该细胞。将含有DNA转染试剂复合物的溶液加入至细胞，孵育约3-4小时。然后用新鲜培养基替换含有转染试剂的培养基。最后在一个或多个特定时间点分析该细胞。这显然是一个耗时的过程，特别是当待转染的样品数目非常大时。