[发明专利]基于渐消波生物传感器的实时PCR微阵列

说明书

发明领域

本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，并且具体涉及多 个核酸实时、同时定量测定的系统和方法。

发明背景

在基础生物学研究中以及例如临床微生物学领域中，核酸 定量测定十分重要。通常在两个阶段里完成定量测定。首先将样品中 的靶核酸扩增，以产生用于定量化工具的可检测量的核酸。然后将可 检测量的靶核酸用于计算样品中最初存在的核酸的量。

聚合酶链反应(PCR)是扩增核酸的强大途径，尤其是脱 氧核糖核酸(DNA)。对实践PCR关键的是热稳定性DNA聚合酶 的使用，即，能催化DNA复制的蛋白质，在将DNA螺旋分离成两 条单链核酸所需的升高的温度下，该蛋白质不变性。

通过将靶双链DNA放置于核苷酸缓冲液中，同时提供叫 做引物的单链DNA小序列和热稳定性DNA聚合酶来启动PCR，该 引物与靶DNA互补。通过在三个阶段循环混合物的温度，可以将靶 DNA指数扩增。第一阶段是高温(94℃)变性阶段，此阶段中双链 DNA分离成两条单链。第二阶段是低温(60℃)退火阶段，此阶段 中引物与单链DNA结合。最后，延伸阶段在中等温度(72～78℃) 发生。在延伸阶段，DNA聚合酶催化已经与靶DNA单链退火的引物 的延伸，从而添加合适的核苷酸直到完整的双链DNA螺旋形成。在 每一个PCR循环中，靶DNA的拷贝数几乎加倍，从而使得靶DNA 能够快速积聚。

原则上，在一系列PCR循环结束时产生的靶DNA(也称 作“终产物”)的量与原始样品中靶DNA的拷贝数成比例。然而， 实际上，扩增的指数特性，以及启动复制的引物退火的微妙，导致饱 和和其他作用，其使PCR终产物成为对原始样品中靶DNA量的非常 不可靠的估计。

为了改进原始的PCR方法，20世纪90年代中期，开发 了实时聚合酶链反应(实时PCR)，其在某种程度上避免这些困难 并且提供样品中任何靶DNA拷贝数的可靠的、准确的定量测量。在 实时PCR中，将仅当与靶DNA结合时才有活性的荧光探针添加入 PCR缓冲液中。这些荧光探针是单链DNA，链中部有与靶DNA互 补的核苷酸序列。该中部的每一侧，是彼此互补的延伸核苷酸序列， 以便未附着的探针可以以发夹构型自身折叠。荧光探针一端有荧光分 子，另一端有荧光猝灭分子。所以未附着的、折叠的探针有彼此相邻 的发荧光和猝灭分子，并且因此当照射未附着的探针时没有荧光被发 射。然而，当荧光探针附着于其靶DNA时，探针是非折叠的，这样 发荧光和猝灭分子彼此分离。当用合适波长的光照射附着的探针时， 荧光分子因此发射荧光。

通过为特定的靶DNA提供足够的荧光探针，并且测量 PCR反应每阶段结合的探针发出的荧光，可以测量反应每个阶段的 扩增子数目。由于达到预定阈值的扩增子数目的循环的分数与原始样 品中拷贝数的对数之间存在直线关系，所以这种测量可以用于非常精 确地测定原始样品中DNA的拷贝数。

使用这种方法，实时PCR可以用于测定一种样品中靶 DNA的量，在9个数量级的范围内误差小于2％，即，它能计数小到 5，且多达五十亿条原始样品中的靶DNA拷贝链。

然而，实时PCR技术确实有局限，其中最重要的是，由 于具有合适的对应的荧光激发光源的合适荧光染料数目有限，所以迄 今为止实时PCR仅能测量一个反应管中少数的核酸。

对很多应用而言，多于一种核酸的同时定量分析是高度需 要的。所需要的是一种仪器和方法，其允许实时PCR使用少量荧光 染料，并且优选仅一种荧光染料，用于同时定量数百种不同核酸。

发明概述

本发明提供样品中多个核酸同时、定量测量的一种系统和 方法。

在示例性的实施方案中，在单一反应室中用聚合酶链反应 (PCR)、逆转录PCR、滚环(roll cycle)复制或T7转录线性扩增来 扩增样品中所有的核酸，其中扩增缓冲液中额外含有荧光标记的核苷 酸或荧光标记的引物，从而靶核酸的扩增子能进行自身荧光标记。

在扩增过程的退火和/或延伸阶段期间，以预定的二维模 式，通过与已经排列且系于基底表面的寡探针(oligoprobe)进行杂 交，将荧光标记的靶核酸扩增子定位于基底表面上。寡探针有与靶核 酸互补的核苷酸序列，并且可以使用商业上可获得的微阵列技术，通 过自动印刷将其排列。