[发明专利]新型的L－赖氨酸－诱导型启动子

说明书

技术领域

本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子、包含该核酸分子的载体、用该载体转化的宿主细胞和使用L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。

背景技术

棒状细菌(Coryneform bacteria)是生产在动物饲料工业、药品工业、食物工业和类似工业中具有多种应用的化学物质的工业微生物，所述化学物质包含L-赖氨酸、L-苏氨酸和多种核酸。为了通过基因工程或代谢工程从这些棒状细菌中开发高效价菌株，在棒状细菌中涉及几个代谢途径的基因表达应该被有选择地调节。因此，需要对该基因调节有用的启动子序列。

在棒状细菌上一旦发生基因表达，基因通常从它们自己的启动子表达(Vasicova，P.，等，J.Bacteriol.181，6188-6191，(1999)，等等)。然而，不像其它的工业微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，没有关于在棒状细菌中负责基因表达的启动子序列的基本结构的信息。因为这个原因，通过以下步骤开发出启动子：从与抗生素抗性相关的基因中除去启动子区，抗生素例如氯霉素；引导从棒状细菌分离的并使用适当的限制性内切酶消化的染色体DNA进入启动子位点；使用所形成的DNA分子转化棒状细菌；评估所获得的菌株的抗生素抗性(Eikmanns，B.J.等，Gene，102，93-98(1991)；Patek，M.等，Microbiology，142，1297-1309(1996))。然而，考虑到目标基因的选择性表达和表达效率，先前开发的启动子序列仍然需要进一步改进。

涉及启动子分离的传统方法包括：(1)启动子探针载体系统在报道基因上游的基因组DNA片段的随机克隆中的使用，该报道基因仅当克隆的片段中包含启动子活性时才进行表达；(2)基于基因特异性探针的杂交，通过该杂交，基因和它的启动子从基因组文库分离出来；以及(3)诱导性的cDNA探针和非诱导性cDNA探针与基因文库的差示杂交。

近来发展的使用2维(2-D)凝胶电泳的比较蛋白质组分析是鉴别在不同的生理状态下差异表达的蛋白质的技术。基于差异表达的蛋白质，许多研究已被施行以便鉴定能增加蛋白质表达的调节基因。

基于这个背景，本发明人对存在赖氨酸时表达被诱导的蛋白质进行了2-D凝胶电泳，以及通过比较蛋白质组分析检测和鉴别了显示差异表达图式(pattern)的蛋白质。当与鉴定的蛋白质的推定的启动子区相对应的多核苷酸通过PCR扩增并被引入缺少启动子的lacZ基因的上游时，观察到在存在赖氨酸时β-半乳糖苷酶的活性显著增加，从而导致了本发明，其提供能在赖氨酸存在时诱导基因表达的新型启动子核酸分子。

发明内容

因此，本发明的一个目标是提供新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。

本发明的另一个目标是提供包含该新型的启动子核酸分子的载体。

本发明的进一步的目标是提供用该载体转化的宿主细胞。

本发明的还有另外一个目标是提供使用新型的启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。

附图简述

结合附图，通过下面的详细描述，本发明的上述和其它的目标、特征和其它优点将被更清楚的理解，在附图中：

图1表示存在和不存在赖氨酸情况下培养的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的全细胞裂解产物的2-D凝胶电泳的结果，其中差异表达的蛋白质用箭头表示；以及

图2是构建用于监控启动子活性的载体的方法的图示，其中β-半乳糖苷酶被用于检测启动子活性。

实施本发明的最好的方式

一方面，本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。

具体而言，本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子具有SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列。

依照本发明的启动子核酸分子的核苷酸序列可使用几个近来发展的方法中的任意一个修饰到一定的程度，这些方法例如定向进化或定点诱变。本领域技术人员容易地认识到，经过这种人工修饰具有70％或更高同源性的核苷酸序列衍生自本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列，只要它保持了用于表达靶基因的启动子活性。

因此，本发明的L-赖氨酸诱导型启动子核酸分子包括与上述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-赖氨酸-诱导型启动子的核苷酸序列。