[发明专利]使用天然型L－半胱氨酸或其衍生物的萤火虫发光基质的生物合成系统及包含本系统的发光基质溶液

说明书

技术领域

本发明涉及一种更简便且容易地得到稳定的基质的方法以及半胱氨酸、ATP、基因表达的测定法。所述发光基质如下得到，将应用范围广泛的天然型L-半胱氨酸为底物在反应溶液内直接合成，得到作为检测哺乳动物的基因表达的报告基因有用的发光甲虫荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶、铁道虫(Phrixothrix hirtus)荧光素酶、金针虫荧光素酶、大场雌光萤(Rhagophthalmus ohbai)荧光素酶)的发光基质。

背景技术

发光甲虫的发光基质是以醌类及D-半胱氨酸为起始物质的化合物荧光素(非专利文献1)。迄今为止，根据注入萤火虫生物体内的标识化合物的取出实验，证明醌或氢醌是被荧光素取出的且醌类为起始物质(非专利文献2)，另外，认为其再生路径为：荧光素→氧化荧光素→2-氰基-6-羟基苯并噻唑→荧光素(非专利文献3)。另一方面，推测荧光素的2’C来自半胱氨酸的α位(非专利文献4)。根据这些观点，总结出图1所示的迄今为止的见解。在萤火虫体内，存在于被确认的合成路径中的物质群为醌(4)、2-氰基-6-羟基苯并噻唑(3)、D-萤火虫荧光素(1)、氧化荧光素(2)。连接这些点的工作很重要，但并不是直接的研究进展。其中，在推测原料为(4)时，在开始发生的反应A中，半胱氨酸(5)或半胱氨酸-半胱氨酸(7)发生反应。然后可以推测反应B或C。推测反应B是在内部作成苯并噻唑环(11，12)，或者反应C是作成噻唑啉环(10)，而且，从反应B到反应C、或从反应C到反应B成为代谢路径，接下来合成萤火虫荧光素(1)。目前，依照该线路，以比天然型昂贵的D-半胱氨酸(6)为底物合成萤火虫荧光素。

另外，发现将作为发光反应生成物的氧化荧光素(2)交换为2-氰基-6-羟基苯并噻唑(3)的酶(非专利文献5、非专利文献6)，通过添加酶，可以使2-氰基-6-羟基苯并噻唑(3)和D-半胱氨酸(6)作用，使荧光素再生，从而可以持续发光(专利文献1)。总之，为了测定发光甲虫荧光素酶的活性，D-萤火虫荧光素(1)是必要的，为了制造该D-萤火虫荧光素，必须使用比天然型昂贵的D-半胱氨酸(6)。

另一方面，有报告称，由天然型L-半胱氨酸合成L-萤火虫荧光素，即使使其与发光甲虫荧光素酶反应也不发光，而且，合成的L-萤火虫荧光素不发光(非专利文献7、非专利文献8)。但是，近年来，也有报告报道由L-萤火虫荧光素发光的相反的实验结果(非专利文献9)。另外，还有报告称由L-半胱氨酸合成的L-萤火虫荧光素成为腺苷化荧光素容易被消旋化(非专利文献10)，以L-半胱氨酸为底物的萤火虫发光系统没有被充分地研究，没有定论。