[发明专利]用作细胞内转运目标分子用载体的毛若考辛衍生多肽

说明书

技术领域

本发明涉及能进入细胞并将目标分子转运至这些细胞中的毛若考辛(maurocalcine)衍生多肽。

背景技术

某些物质，尤其是具有药理学特性的大分子，其穿越质膜的转运问题，以及其进入各个细胞内小室的问题，尤其是进入细胞质小室和细胞核小室的问题，是生物技术研究和生物医学研究、以及制药工业的难点。

在目前已知的用于将物质导入细胞内的方法中，转运多肽，亦称CPPs(细胞穿膜多肽)是特别好的载体(具体综述特别参见：Prochiantz，Curr.Opin.Cell.Biol.，2000，12，400-406；Lindgren等，Trends Pharmacol.Sci.，2000，21，99-102)。

实际上，这些小分子能够以不依赖转运蛋白和受体的方式穿越细胞膜，并能在体内和体外于所有类型的细胞中以较低的浓度、不消耗能量、有效(100％的细胞转导)、高速地(5～15分钟的数量级)转运大分子比如蛋白质和核酸，而对这些大分子而言所述膜是非通透性的。此外，有显示表明这些多肽中的一些能够穿越血脑屏障(Schwarze和Dowdy，Science，1999，285，1569-1572)。

这些由以不依赖转运蛋白和受体的方式穿越细胞膜的多肽所构成的载体，不同于其他的包含糖肽或与PEG偶联的多肽的载体，其中带正电的多肽用于缩聚DNA，并且PEG或者糖类，特别是通过DNA/糖肽复合体与甘露糖受体或脱唾液酸糖蛋白受体相结合，允许靶向目标细胞(多肽CWCK₁₅CK、CW(CK₃)₄CK和CWK₅CK₅CK₅C(SEQ ID Nos.26～28)：Park等，Bioconjugate Chem.，2002，13，232-239；Kwok等，J.Pharm.Sciences，2003，92，1174-1185)。

目前已知的穿膜多肽分成两种：

*由各种蛋白的膜易位信号序列衍生的多肽(卡波西瘤(Kaposi′s sarcoma)衍生的成纤维细胞生长因子(K-FGF)和免疫球蛋白轻链(Ig(v))；虽然这些多肽的穿越机理尚不清楚，但已知中间的疏水区参与了穿越过程，只是该区域的结构随蛋白质的种类而变化(α-螺旋(K-FGF)或β-折叠(Ig(v))；

*由细胞内信号蛋白或“信使蛋白”衍生的多肽；这些蛋白能直接穿越进入细胞并到达细胞核，从而在细胞核内调控转录过程(HIV-1 Tat、HSV-1 VP22和同源异型蛋白)。

通过功能研究可以确定足以用于这些各个多肽易位所需要的最小序列：

-  能够穿膜并用作其他蛋白或寡核苷酸的载体的最小同源异型蛋白片段是43-58位氨基酸的多肽，即与同源结构域螺旋3相对应的穿透蛋白(Derossi等，J.Biol.Chem.，1994，269，10444-10450和国际专利申请WO 97/12912)。对该序列的突变体的研究结果表明，α-螺旋结构不参与细胞内易位，但在核转运中起作用。另一方面，在位置48处的W残基对易位是重要的，并且多肽的两亲性特点是必需的，但尚不足以导致易位。相关的辅助性研究已经证实了W48残基的重要作用，并且证实了带正电的氨基酸(赖氨酸和精氨酸)与带负电的膜磷脂间相互作用的重要性。基于这些研究，人们提出了反向微胶粒模型。根据该模型，穿透蛋白通过静电作用而在细胞表面处保持稳定，在位置48处的色氨酸迫使反向微胶粒形成，该反向微胶粒俘获多肽并将其传递至细胞质中；

-VP22蛋白的267-300位片段与用于内化的最小序列相对应(Elliot和O′Hare，Cell，1997，88，223-233)；

-Tat蛋白中最有效的片断是48-60位片段，该片段对应于整个碱性区，并且包括核定位信号。然而，较短的片断(47-57位)能够在体内和体外于各种类型的细胞中以融合蛋白的形式将15～120kDa的蛋白转运，并且能穿越血脑屏障。此外，不同于人类病毒中的Tat多肽，马病毒中的Tat多肽具有类似于同源结构域的结构。

这些功能研究还不能阐明这些多肽穿越的一般机理，从而不能确认尤其对这些多肽的易位起作用的共有序列和/或结构元素。