[发明专利]同时检测和鉴定引起人体呼吸感染多种病毒的探针和方法

说明书

技术领域

本发明涉及核苷酸序列的检测，尤其是用于同时检测单一检验样品中的多数核酸序列的探针和检验。更具体些，本发明涉及到检测引起人体呼吸感染的病毒的多数核酸序列的探针和方法，通过杂交的方式，最终在单个检验样品中得到体现，病毒中包括：A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合。

背景技术

从临床学的观点来看，由不同病毒甚至一些细菌引起的呼吸道病毒感染的迹象和症状一般很难进行区分。因此有必要提供一种不仅能够鉴定引起感染的病原物，还能使这一鉴定过程在短时间内就能完成的诊断工具，这样所得结果才能有助于快速实施适当的治疗或者缓解病情的措施，同时，在由病毒引起感染的情况下，能够避免抗生素不必要的施用，避免了耐药细菌的产生。另外，快速而可靠的病毒性感染的诊断方法对于可能通过施用抗病毒药物进行治疗的病毒性疾病，例如流感病毒的情况，是极为重要的。这对于降低高危人群，例如老年人、婴幼儿和免疫力低下的病人，由这类病毒引起的病死率将发挥极大的作用。考虑到新型的抗病毒药物可能在不久的将来问世，对于灵敏的诊断方法的需求也将增大，这类微生物实验室中的常规方法可以快速鉴定引起呼吸道感染的不同病毒。

因此，检测和鉴定引起上呼吸道感染的导致临床无法区分迹象和症状的病毒的实验室诊断显得尤其必要。有一种观点被错误地认为，例如，从一个病人身上可以将链球菌性咽炎与病毒生咽炎中可靠地区分开来。这样的概率甚至可以估算出来(例如，普通感冒的症状对细菌性咽炎的诊断的阴性预测值为80％)，但是这一结果必须通过实验分析手段才能得到证实。

通常对人体病毒性呼吸道感染的病因诊断，到目前为止，是运用传统方法，例如分离自细胞培养物或者通过间接免疫荧光(IF)技术，这些方法虽然具有较高的灵敏度，但是只允许，除了极少数情况下，区分一种以上共同感染样品的病毒的存在，这可能由几个因素造成，例如：(i)高细胞病变活性病毒对细胞单层的破坏，可能掩盖了对样品中可能存在的其他生长较慢或者细胞病变作用较不明显的病毒生长的检测，同时(ii)掩盖了用于鉴定的共同感染样品的病毒的特定单克隆抗体的未利用率。因此，对共同感染的诊断由于缺乏足够灵敏和特异的检测技术而被低估。

基于对临床样品或者细胞培养物中病毒基因组检测的常规检验如今正越来越多地被引入常规临床诊断。允许检测病毒基因组的检验类型通常基于杂交法或者扩增法。

在第一种情况(杂交法)，病毒基因组可以通过利用探针或者寡核苷酸而被检测出来，这样的探针或者寡核苷酸带有一段可能出现在待检测样品中的病毒基因组的同源序列。这类技术通常简单并且利用非放射性方式显示出来，例如通过荧光或者化学发光。基于杂交法的方法在特异性、灵敏性和对样品中病毒核苷酸总量(病毒负荷量)的定量可能性方面也具有优势，这可以用来监控病人对抗病毒治疗的反应。

基因组扩增法允许将某种病毒的基因组序列扩增几百万倍以便使它们可以很容易被检测出来。聚合酶链式反应(PCR)在简单和多种格式中已经被证明是在病毒引起的呼吸道感染诊断中的一个非常灵敏而且特异性很高的基因组扩增方法。基于通常情况下，传统的呼吸道样品(鼻咽冲洗或抽吸物、咽涂片、漱口液等)中病毒的数量通常稀少的事实，基因组扩增在呼吸道感染诊断的检验中的应用相对常见。因此，为了得到最高的灵敏度，通常有必要在第一次扩增反应结束后，对获得的片段进行第二次扩增，例如，用套式PCR。一般来说，第一次扩增反应是RT-PCR(RT：逆转录或反转录)，因为大部分引起人呼吸道感染的病毒有一个由RNA构成的基因组。即使套式PCR操作起来很简单而且容易引入诊断实验室的常规程序，基于病毒基因组片段的大量扩增导致相邻样品片段的扩增产物可能导致样品受到污染的事实，这一方法仍是假阳性的可能来源。所以为了能够在常规条件下操作套式PCR技术，有必要采取特殊的预防措施，包括，例如，扩增程序的步骤必须在物理上分隔的实验室进行，使用不同的层流舱，每个里面提供的反应物、微量移液器装置、无菌管和无菌过滤器，都是完全独立的。在小型实验室或者不能提供足够试验材料或设备的实验室，这通常是不太可行。